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测序金标准之旅丨片段分析这么有用,您pick了吗?

2019-09-05

 

基因分析仪通常称为测序仪主要是因为它们最常被用于Sanger测序。但对于这一广泛的DNA测序技术,您可能不知道的是,您的基因分析仪也可以用于测定DNA片段的大小,称为“片段分析”。这是指一种广泛应用的遗传分析技术,适用于突变检测、基因分型、DNA图谱测定、遗传谱系绘制以及连锁分析等应用。



Wow,原来它的原理so easy!


在大多数片段分析应用中,待分析的未知DNA片段使用荧光标记的引物,通过PCR生成荧光标记的PCR产物并与分子量标准品混合。分子量标准品是使用与未知片段不同的荧光染料标记的已知大小的DNA片段混合物。


随后,使用热循环仪对该样品进行变性处理,我们推荐使用“Veriti”热循环仪,再将样品放在基因分析仪中进行分析。当已知和未知的DNA片段混合物进样到基因分析仪中,在毛细管迁移时会根据片段大小进行分离,较小的片段移动较快,而较大的片段移动较慢。


系统照相机根据所使用的染料对每个标记片段进行检测,所产生的荧光信号会生成一个峰,然后,使用GeneMapper软件分析电泳图中的峰。根据分子量标记物中每个已知DNA片段的分子量及其对应的迁移时间,生成分子量标准曲线,该曲线可用于精确确定未知片段的大小。


它的优势,您get了吗?


基因分析仪进行片段分析的一个非常大的优势,是它的多重分析能力。当您想要分析不同大小范围的DNA片段时,这些片段可用相同的染料标记并在毛细管中进行分离。然后再进行单独检测,这些都没有问题。但是当片段的分子量范围完全重叠或者部分重叠时,您将无法分辨哪个峰对应哪个片段,这就需要荧光多重分析能力。使用基因分析仪可以同时检测多个染料。因此,您可以使用不用染料标记大小范围相近的DNA片段。这些片段大小和荧光标记组合实现高水平的多重化,使您能够在单次迁移中分析多个片段。


使用基因分析仪进行片段分析的另一个优势,在于可实现的灵敏度。且不说您可以使用任何类型的DNA模板,您甚至可以使用血斑或者FFPE这样难分析的样品。与测序不同,大部分片段分析应用不需要在电泳前进行复杂的样品制备和纯化。而且,由于根据分子量大小进行结果确定,所以数据解读非常简单。您可以在基因分析仪上运行多种片段分析应用,并且不需要预先知道DNA序列。您还可以在相关定量应用中使用峰强度测量。


您只需要加入一点创造力,就可以随时开发一款自定义片段分析应用。


 

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