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赛默飞助力医学研究系列专题——肿瘤研究(三):肿瘤稀有突变检测,突破Sanger测序瓶颈

2019-09-05

 

使用Sanger测序检测5%的体细胞变异

低频突变是指对于特定等位基因突变比率少于25%的单核苷酸多态性(SNP),低水平体细胞变异检测对肿瘤、传染病、遗传病等很多研究领域都非常关键。Applied Biosystems™ Minor Variant Finder软件是一款针对Sanger测序检测和报告低频突变的需要而开发的新型软件。通常此类低频变异的拷贝数非常低,而Minor Variant Finder软件具有更高的检测灵敏度,确保Sanger测序成为肿瘤学家和病理学家检测低频(5%或更低)体细胞变异的理想选择。

根据具体的癌症类型,使用Minor Variant Finder软件和金标准的Sanger测序,可以简便快速的检测出癌基因(例如KRAS,NRAS等)和抑癌基因(例如TP53)的相关变异数,也是验证二代测序(NGS)检测结果的重要方法。


01

可检测低至5%的低频突变

Minor Variant Finder软件的创新算法在于使用一个对照样本扣除背景噪音,可检测低至5%的低频突变。通过该软件最大限度的降低噪音,导入的Sanger测序数据可形成清晰的电泳图谱,因此可以直观的验证这些低频变异。该软件还设置了各种评审指标,有助于在分析之后检测出任何可能的低频变异。正向和反向均可检测到低频变异,进而验证相关结果。


02

更低的成本测序,1到96个靶标扩增子

检测有限数量的靶标时,Sanger测序是较为经济的选择。Minor Variant Finder软件具有更高的检测灵敏度,确保Sanger测序成为肿瘤学家和病理学家检测低频(5%或更低)体细胞变异的理想选择。此外,该软件也提供了一种对固定的基因试剂盒进行扩展的简单、灵活方法。


03

更快获得关键结果

充分利用Sanger测序快速获得结果的优势,从样本到结果可在一天内完成——让您更快获得关键结果。


04

使用比对视图和维恩图,验证NGS结果

对于使用NGS技术的高通量实验室,NGS结果中的轻微变异可通过Sanger测序验证,此方法快速且成本低廉。验证结果可通过比对视图和维恩图直观显示。


05

简单的工作流程

该软件不需要您变更现有工作流程,可与您实验室现有的Sanger测序工作流程完全兼容。



使用毛细管测序仪、Minor Variant Finder软件检测低频突变


序言

使用下一代测序仪和数字PCR进行低频突变基因的筛选和检测,在临床领域的应用受到越来越多的关注。通过超多重PCR扩增技术和新—代测序仪的Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2,仅使用10ng DNA即可—次筛查约2800种突变,通过正常读取数据和突变读取数据直接比对,可以计算突变率。另— 方面,使用经典Sanger测序时,难以检测出低于25%的低频突变。而本篇文章中介绍的Applied biosystems™ Minor Variant Finder软件,可通过毛细管测序仪,检测出低至5%的低频突变。同时,为了验证该软件所检测的突变,同时结合数字PCR (dPCR)方法加以验证。而且,在千叶县癌症中心临床染色体组研究部横井佐奈部长的大力协助下,我们还尝试使用临床样本,检测EGFR基因的低频突变。


Minor Variant Finder软件 

Minor Variant Finder (MVF)软件是—款为使用毛细管测序仪、检测低至5%的低频突变而开发的新型软件。传统毛细管测序仪的软件,是根据突变峰高与主峰高的比值进行检测,可检测25%左右的突变率。而低频突变的突变峰值隐藏在测序数据的背景噪音中,难以检测。


MVF软件中搭载依托Applied Biosystems长期使用并被公认的测序算法。通过最大程度扣除背景噪音信号,可通过对照样本中区分出背景噪声,目视检测出突变峰值。从而检测出过去难以识别的,低至5%突变的峰值。而且,该软件可读取新一代测序仪的vcf文件,从而比对新一代测序仪和毛细管测序仪的结果,并对检测到的突变加以注解。不仅如此,无需更改以往的实验流程即可使用新型MVF软件。使用毛细管测序仪的检测文件(.ab1文件),分析更简单。


方法及材料 

1. 毛细管测序仪

为验证突变,使用人工基因合成服务lnvitrogen™ GeneArt™ Strings™ DNA Fragments,人工合成包括人体EGFR Exon21区域在内的600bp的DNA (图4)。合成含有野生型和突变型两种基因 (COSMIC 6213)的样本, 分别混合成突变型比例为2.5%、5%、10%、20%、50% 的样本。使用Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit,样品量6ng,  正向引物及反向引物3.2pmol 的条件下,进行循环测序反应 。使用Applied Biosystems™ BigDye™ XTerminator™纯化试剂盒纯化后,在Applied Biosystems™ 3500xL基因分析仪上,使用POP-7™聚合物、50cm毛细管阵列进行电泳。MVF软件处理所得数据,检测突变。


2. 数字PCR

使用Applied Biosystems™ QuantStudio™3D数字PCR系统,验证dPCR方法的突变频率。把同—样本进行倍比稀释,得到104份重复样品,使用QuantStudio 3D预混液及Applied Biosystems™ TaqMan™SNP基因分型检测体系(检测ID:C_172767645_10),进行反应。


结果分析 

使用MVF软件分析毛细管测序仪生成的数据,可以检测出2.5%~50%的所有混合样品的突变碱基峰值。结果中显示所检测到的突变,并可以立即确认所检测的突变位 置信息和突变信息。另外,通过—键点击,可确认检测的突变峰值的详细信息(图6A-C)。将检测到的突变,汇总整理为基于峰高的突变率,如表1所示。由于ddNTP 的扩增效率和所标识的荧光物质强度不同等原因,毛细管测序仪中没有峰高的定量指标,所以基于峰高的突变率和dPCR结果有些许差异。但是,通过使用MVF软件,可以检测以往无法检测到的2.5%突变样本。另外,虽然没有严格的定量指标,但仍可以看出基于峰高的突变率随着突变型混合比例减少而减少。


这次的实验中,可以检测出包括2.5%这种极低频率在内的所有突变,无任何假阴性。


另—方面,5个样本中共计检测出11个突变峰值,其中有6处判定为假阳性。其突变率低至百分之几,且在正向结果和反向结果中超过几倍的差异,其原始数据在该位置噪音较大(图6)。MVF软件可以直接根据各自的峰值,并做出判断,所以可以成为偏离正向和反向的突变率及原始数据噪音大小的判断依据。


在千叶县癌症中心临床染色体组研究部横井佐奈部长的大力协助下,对人体样本也进行了相同的突变检测。结果显示MVF也可检测出人体DNA样本的突变。


结论  

通过使用MVF软件,可以从人工合成样本和实际人体DNA样本中,检测出传统软件难以检测的低于25%的突变。另外,在本次验证试验中,甚至可以毫无遗漏的检测到包括2.5%这种极低突变频率在内的所有低频突变。综上,展示了本软件在新—代测序仪的突变数据验证和癌症研究中低频突变的检测等染色体组的研究中的实用性,也期待本软件可以帮助我们进—步提高研究的精度和效率。