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生物制品下一代表征利器创新巅峰Orbitrap Eclipse™质谱仪

2019-06-26

上一期中我们介绍了Orbitrap Eclipse™三合一质谱仪极其出色的硬件性能,以及在蛋白质组学领域的非凡表现。本期带大家领略其如何将生物制品质谱表征工作变得更简单、看到生物制品最真实的原貌!

当前常规生物制品质谱表征主要包含完整分子量的测定、肽图解析、糖型鉴定等,通常利用不同的样品前处理获得复杂生物制品的完整分子量、氨基酸序列结果,然而在一定程度上却失去了样品的完整信息,引入其他副反应。大家知晓可以用Top-Down、Middle-Down的分析流程解决这一问题,但由于质谱仪性能的局限,未得到广泛的应用。

赛默飞作为科研领域的先者,致力于解决分析难题,全能型Orbitrap Eclipse™将“简单又复杂”的生物制品质谱表征带入了“Top/Middle-Down时代”

 

 

1复杂生物制品的完整分子量测定——糖基化位点较多的融合蛋白类

得益于PTCR(质子转移电荷减少)技术、深度真空技术(气压可调0.5-20mTorr)。

单克隆抗体及ADC类蛋白样品异质性相对较低,在传统的LC-MS/MS(变性反相色谱或非变性分子排组色谱条件)中能够获得高信噪比、高质量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位点较多的融合蛋白类,如细胞因子融合蛋白,异质性非常高,即使在非变性去唾液酸条件下仍旧无法有效区分每一成分(图1A),通常的解决方式是使用各种糖苷酶去除不同种类糖型,降低谱图复杂性,然而却失去了样品的完整水平糖型信息。

图1. 细胞因子融合蛋白分子量测定; 1A. 去唾液酸后在native条件质谱图 1B.经过PTCR反应后质谱图 1C.经BioPharma软件去卷积后的各成分质量(Data Courtesy: Wendy Sandoval, Genentech)

Orbitrap Eclipse™ 针对不同的样品分析可调节IRM中气压,提高信号响应,以及PTCR强力的加持技术则可简单快速的解决此类困扰已久的难题,如图1所示,在图1A中选择带多质子且信号强度较高的m/z5677-5757范围,经PTCR反应后降低质子数,从而降低各电荷态间的重叠度(图1B),此时可清晰的分辨每一成分,BioPharma Finder软件去卷积后获得该融合蛋白主要成分的分子量(图1C),为复杂生物制品的表征提供完整信息。

2非变性蛋白Top-Down分析

得益于ETD、EThcD、UVPD、HCD、深度真空技术、HMR、PTCR技术

(全能型Orbitrap Eclipse™三合一质谱仪集各种利器于一身)

对于做蛋白药物质谱表征分析的人来说,理想的状态是使用快速简单甚至无需样品前处理,直接进入LC-MS/MS或MS only对蛋白药物进行表征,高效且降低样品前处理引入的干扰,同时可直接对电荷变异体成分进行快速的确证。而现实是由于抗体分子大,碎片离子少且复杂导致在完整蛋白水平获得较低的序列覆盖度,实用价值低。Orbitrap Eclipse™将非变性完整蛋白Top-Down分析推向崭新的高度。

以Herceptin®抗体为例,溶液置换成50mM乙酸铵(Herceptin®浓度为2ug/uL),不经LC通过注射泵直接进入MS中,获得高信噪比高质量精度的一级谱图(图2),隔离丰度最高的母离子(+27价)分别进行HCD、ETD、EThcD及UVPD的碎裂,且使用Orbitrap 240,000分辨率进行高准确度二级碎片离子扫描,由于Orbitrap Eclipse™具有HMR选项,可在二级谱图中看到m/z达8000的丰富碎片离子。

图2.非变性Herceptin®高质量精度的一级质谱图,不同碎裂模式下的二级质谱图

 

图3. 经BioPharma Finder解析后轻重链氨基酸序列覆盖度

经BioPharma Finder解析后,轻链氨基酸序列覆盖度为57%,重链氨基酸序列覆盖度为36%(图3),碎片离子质量偏差在3ppm以内,Orbitrap Eclipse™在非变性条件下Top-Down结果刷新了以往的记录¹

 

值得注意的是,PTCR技术不仅在复杂生物制品分子量测定中大显身手,而且能够显著降低ETD MS²谱图的复杂度(图4),大大提高质量碎片离子的解析度(图5),从而提升Middle-Down氨基酸序列的覆盖度(图6)。

图4.NIST mAb Fd亚基经ETD碎裂以及PTCR反应后的二级碎片离子质谱图

 

图5.ETD only与ETD with PTCR二级/三级碎片离子鉴定分布图

 

图6.NIST标准抗体Middle-Down氨基酸序列覆盖度

3基于以上独特的优势性能,可进一步扩展其应用领域

如电荷变异体的快速鉴定;利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide复合物筛选高免疫原性疫苗时,采用Orbitrap Eclipse™测定复合物的完整分子量和Top-Down,来评估多肽的交换(图7);此外多种碎裂方式与超高分辨率Orbitrap的组合能够更加准确的对未知蛋白进行从头测序(De-novo sequencing)。

图7.Orbitrap Eclipse™评估MHC与多肽的交换,助力高免疫原性疫苗的筛选(Data Courtesy :Genentech)

 

结语目前Orbitrap Eclipse™是功能最为齐全的高分辨质谱仪之一,旨在解决蛋白质分析中极具挑战的问题,持此利器定能推动生物学研究的进一步发展。

至此,ASMS新品连载正式完结啦!快和赛默飞一起回顾下赛默飞2019新品质谱的精彩瞬间~

赛默飞于ASMS 2019上发布的两款新品质谱再次刷新了Orbitrap的记录——

全新一代Q Orbitrap旗舰机 Orbitrap Exploris™480 质谱仪,体积小巧但性能超强,稳定耐久。天才不“繁”,势必将蛋白质组学,尤其是临床蛋白质组学研究推向新的高度。

堪称创新巅峰之作的全能型Orbitrap Eclipse™三合一质谱仪,集各种高能软硬件技术于一身,性能比尖,轻松应对蛋白质组学,生物制药与蛋白质高级结构分析研究中的各项挑战。

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