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单细胞全长转录组 × 靶向富集—低表达基因融合事件快现形！
在生物体中，对各类低表达事件开展分析鉴定研究，一直以来为科研人员津津乐道。但是要想对它们进行准确地检测鉴定，却并非想象中那样容易。
在热度颇高的肿瘤研究领域，关于稀有融合基因、转录异构体的研究一直备受关注。有研究表明，这些低频事件是与癌症发生相关联的（Yu et al. 2019，Mertens et al. 2015）。
ICELL8 cx Single-Cell System是基于微孔芯片技术的高通量单细胞分选系统，用于高通量的单细胞NGS研究。ICELL8 cx系统及其配备的单细胞全长转录组应用为广大科研工作者带来了应对低表达生物学研究的好方法。现在就和大家一同来看一看，单细胞全长转录组 和 靶向富集 配合时是一种怎样的研究体验。
介绍案例之前，先对ICELL8 cx单细胞全长转录组应用做一个简单的讲解：
下面的示意图展示了单细胞全长转录应用的实验流程。
首先，将细胞样品分注到微孔芯片中完成单细胞的分选工作。然后，为选中的单细胞加入RT-PCR试剂，进行转录本的cDNA合成。得到cDNA后，继续添加P5 index接头序列。接着，我们要对全长cDNA进行酶切片段化。完成片段化操作后，继续加入P7 index接头序列，进行一次PCR反应，将P5 index / P7 index接头连接到文库片段两侧，并扩增。最后，将连接好接头序列的文库产物从芯片中回收，并进行一次PCR扩增，以达到测序仪的上机要求。
介绍太抽象，不够具体？
没关系！看看ICELL8 cx单细胞分选系统的操作软件界面展示的单细胞全长转录组应用流程：
示意图中展示了芯片内五个反应步骤，在软件界面上一一对应了按键。细心的您可能发现，其中多了一个“Scan chip”按键。它用于对分注了细胞样品的芯片进行扫描拍照。获取的图像信息会经过ICELL8 cx搭载的CellSelect软件分析处理，提供一份微孔芯片中“活的单细胞”位置信息。后续各种建库试剂的添加仅在这些位置执行。
单细胞全长转录组小课堂结束，我们开始本次的案例介绍！
本次案例中，靶向富集的目标选择了BCR基因和ABL1基因。位于22号染色体上的BCR基因和位于9号染色体上ABL1基因，由于染色体易位的发生，会产生BCR-ABL1融合。通常会导致慢性粒细胞白血病，也就是我们常说的“慢粒”。
除了BCR基因和ABL1基因外，同时也对PAX5，ETV6和EP300，ZNF384进行了富集检测分析。
通过ICELL8 cx单细胞分选系统，分选得到了1,512个K562细胞，选取鉴定到费城染色体（the Philadelphia chromosome）的K562细胞作为阳性对照。
首先完成单细胞全长转录组的测序文库构建。然后，在该文库的基础上对本次选定的目标基因进行富集。本案例中设计的富集探针为5’生物素标记的寡核苷酸探针。
对于未经富集和经过富集的数据统一使用我们的分析软件Cogent NGS Analysis Pipeline进行reads的比对。
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• 对单细胞全长转录组文库进行BCR 和 ABL1富集后，提高了对含BCR-ABL1融合基因细胞的鉴定能力。
对于未经富集的检测组（绿色）来说，即使在reads 深度超过1.6 M的情况下，1,512个细胞中仅40个细胞检测到含有BCR-ABL1融合转录本表达。
相比之下，经过靶向富集的检测组（蓝色），在reads深度582 K的情况下，检测到264的细胞含有BCR-ABL1融合转录本表达。
• 当我们进一步对富集结果进行分析后可以发现，对于BCR-ABL1融合基因来源的junction reads和spanning reads，检测效果均得到显著提升。
| 未富集文库 | BCR- 和 ABL1-富集文库 | |
| BCR-ABL1 junction reads | 13 | 1,735 |
| BCR-ABL1 spanning reads | 39 | 6,420 |
| 鉴定到任意一种融合的细胞数 | 590 | 280 |
| 鉴定到BCR-ABL1融合基因的细胞数 | 40 | 264 |
参考DepMap数据库信息，ICELL8 cx单细胞全长转录组应用成功鉴定到了K562细胞中预期可以被检测到的几种融合基因。
对于未经富集的文库，表达BCR-ABL1融合转录本的细胞数仅占含融合基因细胞总数的~7%（40/590）；经富集处理后，表达BCR-ABL1融合转录本的细胞占比达到了~94%（264/280）。
在需要对稀有事件和特定区域进行深入的研究时，靶向富集方法是一个强有力的工具，可以很好地提升检测能力。通过上面的案例数据，展示了ICELL8 cx单细胞全长转录组应用与靶向富集联用后的强大效果。
关于该案例的更多信息现已进行了汇总，点击下方链接，快来申领吧！
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