在大多数干细胞实验研究中，诱导分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞已经成为鉴定其分化潜能的金标准。今天我们将来介绍一下成软骨诱导分化操作！

⭐ 成软骨诱导分化

软骨的破坏、缺失是骨关节炎（Osteoarthritis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。

近年来，随着间充质干细胞（MSC）的发现和研究深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等优良特性，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的应用潜力。

✔ MSC成软骨分化的过程

MSC首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。

✔ 体外诱导成软骨分化的鉴定

主要是形态学观察、阿利辛蓝染色，以及检测成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Western Blot检测II型胶原蛋白的表达，以及RT-PCR检测II型胶原蛋白的mRNA的表达等不同的角度进行鉴定；而阿利辛蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。

OriCell®间充质干细胞成软骨诱导分化阿利辛蓝染色效果

大鼠骨髓间充质干细胞

人骨髓间充质干细胞

小鼠脂肪间充质干细胞

⭐材料&方法

01 所需材料

OriCell®间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒

◆ OriCell®间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（套装内含基础培养基、成软骨诱导添加物、阿利辛蓝染色液）

◆ 4%多聚甲醛溶液或10%福尔马林溶液

02 诱导分化操作步骤

① 将3~4×105个待诱导细胞转移到15mL离心管中，20℃，250×g离心4min。

② 吸去上清。加入0.5mL成软骨诱导分化预混液，重悬上一步离心所得沉淀，20℃，150×g离心5min。

③ 重复步骤2，再次清洗细胞。

④ OriCell®间充质干细胞成软骨诱导分化添加物II（以下简称添加物II）的添加，按照比例（1mL成软骨诱导分化预混液中加入10μL添加物II），吸取实验所需剂量的添加物II，加入相应体积的预混液中配制成成软骨诱导分化完全培养基，轻柔吹打混匀。

⑤ 将步骤3所得细胞沉淀用0.5mL成软骨诱导分化完全培养基重悬，20℃，150×g离心5min。

⑥ 拧松离心管盖以便于气体交换。将其竖立放置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。

⑦ 当细胞团出现聚团现象时（一般为24h或48h后，视实际情况而定），轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。

⑧ 自接种开始计算，每隔2~3d给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基，每管约0.5mL。

⑨ 持续诱导，直至管内形成直径1.5~2mm的软骨球，即可准备切片染色。

✔ 注意事项

吸取添加物II之前需短暂离心试剂管，使试剂聚集于管底以便取用。

务必将添加物II分装保存在-20℃以下，避免反复冻融，可保存12个月。

加入添加物II的成软骨诱导分化完全培养基务必现配现用，4℃保存不可超过12h。

步骤6，不需要吸去上清或重悬细胞；24h之内不要晃动离心管。

步骤8，每次更换培养基后，都需轻弹离心管，使软骨球脱离管底悬浮在液体中；且更换培养基后务必拧松离心管盖再放入培养箱中。

03 软骨球切片染色操作步骤

注意：本步骤以石蜡切片染色为例。若使用冰冻切片，请遵照切片机使用规程。

① 固定。诱导形成的软骨球用1×PBS清洗后，浸泡于4%多聚甲醛溶液（或10%福尔马林溶液），固定30min以上。

注意：固定液需现配现用。

② 脱水。固定好的软骨球使用梯度浓度酒精脱水，方式如下，每一阶段30min。

50%酒精→70%酒精→80%酒精→95%酒精→无水酒精。

注意：

脱水必须在有盖的容器中进行，防止吸收空气中的水分。

软骨球不要在酒精中浸泡太久，易碎裂。

在更换酒精时，可吸出低浓度酒精，再加入高浓度酒精。避免移动增加软骨球碎裂的风险。

③ 透明。因酒精和石蜡不相溶，所以脱水后需经二甲苯过渡。方式如下：

Ⅰ 二甲苯和无水酒精按体积比1:1混匀。将软骨球浸泡其中2h。

Ⅱ 将软骨球浸泡在纯二甲苯中1.5h。

Ⅲ 更换新的二甲苯，继续浸泡1h。

注意：

透明必须在有盖的容器中进行，防止吸收空气中的水分。

透明过程中，如果软骨球周围出现白色雾状气泡，说明其中水未被脱净。应重新放回酒精中脱水再透明。

④ 浸蜡。为了除去软骨球中的透明剂，使石蜡渗透到内部以便包埋，需要浸蜡处理。

Ⅰ 二甲苯和石蜡按体积比1:1混匀。将软骨球浸泡其中，再一起放置于40℃烘箱中40min。

Ⅱ 将软骨球浸泡在纯石蜡中，放置于55℃烘箱中30min。

注意：

浸蜡尽量保持在较低温度中进行，石蜡不凝固即可。

温度要恒定，不可忽高忽低。

⑤ 包埋。将软骨球取出，置于模具中。倒入石蜡，静置冷却。待石蜡充分冷却成形，取出，修整蜡块。

⑥ 切片。连续切片，每片厚度3μm。

⑦ 粘片。将软骨球切片用粘贴剂粘附于载玻片上，在35℃烘箱中烘干。

⑧ 脱腊。

Ⅰ 纯二甲苯浸泡切片15min，更换新的二甲苯浸泡切片10min。

Ⅱ 二甲苯和无水酒精按体积比1:1混匀。浸泡切片10min。

Ⅲ 依次使用 95%、85%、70%、50%酒精浸泡切片10min，晾干。

⑨ 染色。

Ⅰ 在晾干的切片上滴加阿利辛蓝，37℃染色1h。

Ⅱ 用自来水冲洗载玻片5min，晾干。

⑩ 显微镜下观察阿利辛蓝染色效果。阿利辛蓝染色部分显示的是软骨组织中的内酸性粘多糖。

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