【实操经验篇】鼠源脂肪间充质干细胞的分离培养
脂肪间充质干细胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs）是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪组织均可用于分离ADSCs，其中鼠脂肪组织通常取自腹股沟处脂肪垫。听说你们都想偷师ADSCs原代取材，那就来安排！
⭐ 材料准备
✔ OriCell®大鼠脂肪间充质干细胞完全培养基（货号：RAXMD-90011）
✔ OriCell®胰蛋白酶细胞消化液（0.25%）（货号：TEDTA-10001）
✔ 0.1% I型胶原酶溶液
⭐ 实验步骤
1、10天龄到4周龄大鼠1只，麻醉处死，75%乙醇浸泡消毒3~5min。无菌条件下切开腹股沟皮肤，暴露腹股沟脂肪垫。
2、钝性剥离脂肪组织，清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎，转移至15mL离心管中。
3、加入3~4倍体积的0.1% I型胶原酶溶液，37℃水浴振荡约20min，直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织，辅助消化。
4、250×g，4℃，离心5min。注意离心机预冷至4℃。
5、小心吸去上层油脂，注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL完全培养基,重悬沉淀，转移到新的离心管中，再次离心5min。
6、重复洗涤一次，吸去上清。
7、加入8mL完全培养基重悬沉淀，转移至T25培养瓶中，置于37℃,5% CO2温箱中。
8、待细胞贴壁生长48h后首次观察、换液。
9、换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞。
10、以后每两天更换一次培养基，细胞汇合达80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例首次传代。
⭐ 注意事项
✔ 取材时应将组织清洗干净，仔细剥离去除血管和筋膜组织;
✔ 脂肪组织在剪碎的过程中不能研磨，以免破坏细胞；
✔ 消化完后的组织在离心前把离心机预冷，使细胞更好的与油脂分离；
✔ 用明胶或者胶原蛋白处理培养皿底壁，有利于细胞的贴壁生长。
⭐ 鉴定
1、形态学观察：原代培养后，传代2-3次，ADSCs呈现单层，梭状或多枝状的细胞形态，其直径在25-30 um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞，贴壁较牢固。
2、微生物：常使用培养法和PCR法检测细菌、真菌、支原体。
3、增殖：CCK8生长曲线，计算倍增时间。
4、标记物检测：一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性（>70%）；CD34、CD45、CD11b为阴性（<5%）。
5、诱导分化实验：在特定的诱导条件下，脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。
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