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原核蛋白表达小贴士1 — 宿主菌和表达载体，你选对了吗？
在生命科学的探索之路上，原核蛋白表达重要的技术手段。然而，在这个过程中，科研人员常常面临诸多难点。比如，蛋白表达量低得让人沮丧，好不容易进行实验，却发现经过漫长的等待后只得到微量的产物；或者蛋白错误折叠，形成难以处理的包涵体，使得后续的纯化和研究工作举步维艰；又或者在选择宿主菌和表达载体时感到迷茫，如同在迷雾中摸索，不知哪一个组合才是最佳选择。那么，如何破解这些难题呢？关键就在于正确选择原核蛋白表达的宿主菌和表达载体。你选对了吗？让我们一同深入探讨，寻找成功开启原核蛋白表达之门的钥匙。
原核表达常用宿主菌
1. 大肠杆菌（Escherichia coli）：
优点：
生长快速且培养简单：大肠杆菌是一种生长速度极快的细菌，在适宜的条件下，如使用 LB 培养基，在 37℃下培养，其细胞数量可以在短时间内快速增加，一般几个小时就能达到较高的密度，这有利于快速获得大量的表达蛋白。而且对培养环境和营养条件的要求不高，培养成本低廉。
遗传背景清楚：作为一种被广泛研究的模式生物，大肠杆菌的基因组信息已经被深入研究和了解，其遗传操作方法成熟，便于进行基因工程改造和蛋白表达的调控。
表达水平高：具有较强的蛋白表达能力，能够高效地表达外源基因，适用于小到中等大小的蛋白表达，对于大规模生产重组蛋白具有重要意义。
可选择的表达载体和菌株丰富：有多种不同的表达载体可供选择，如 pET 系列、pGEX 系列等，这些载体具有不同的启动子、标签和筛选标记等，可以根据实验需求进行选择。同时，也有多种大肠杆菌菌株经过改造和优化，适用于不同的表达需求，如 BL21 (DE3)、JM109、W3110、Origami、Rosetta 等。
缺点：
缺乏真核细胞的翻译后修饰能力：原核生物的翻译后修饰系统与真核生物有很大的差异，大肠杆菌无法进行如糖基化、磷酸化、乙酰化等复杂的翻译后修饰，这可能会影响某些蛋白的活性和功能。
易形成包涵体：在表达一些蛋白时，由于蛋白的折叠和组装过程受到影响，容易形成不溶性的包涵体，这不仅会降低蛋白的表达量，还需要额外的步骤进行包涵体的变性和复性，增加了实验的复杂性和难度。
产生内毒素：大肠杆菌会产生内毒素（脂多糖），内毒素的存在可能会影响蛋白的纯度和质量，并且在一些应用中，如药物研发和生产，内毒素的去除是一个必要的步骤，这增加了下游处理的成本和难度。
2. 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：
优点：
分泌表达能力强：具有较强的分泌表达能力，能够将表达的蛋白分泌到细胞外，这有利于蛋白的分离和纯化，减少了细胞破碎等操作步骤，提高了蛋白的纯度和产量。
不产生内毒素：与大肠杆菌不同，枯草芽孢杆菌不产生内毒素，因此在生物安全性方面具有一定的优势，特别适用于对生物安全性要求较高的蛋白质表达。
蛋白折叠正确：细胞内的环境有利于蛋白的正确折叠，能够表达出具有正确构象和活性的蛋白，对于一些需要正确折叠才能发挥功能的蛋白，枯草芽孢杆菌是一个较好的选择。
具有一定的抗逆性：能够在较为恶劣的环境条件下生长，如高温、高盐等，这使得在一些特殊的培养条件下进行蛋白表达成为可能。
缺点：
表达效率相对较低：与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌的蛋白表达效率相对较低，需要较长的时间才能获得足够量的蛋白，这可能会增加实验的周期和成本。
遗传操作相对复杂：虽然枯草芽孢杆菌的遗传操作技术也在不断发展，但相对于大肠杆菌来说，其遗传操作仍然较为复杂，需要较高的技术水平和经验。
可能存在蛋白酶降解：枯草芽孢杆菌细胞内存在一些蛋白酶，可能会对表达的蛋白进行降解，从而影响蛋白的产量和质量，需要采取一些措施来抑制蛋白酶的活性。
3. 乳酸菌（Lactococcus lactis）：
优点：
安全性高：乳酸菌是一种常见的益生菌，对人体和动物无害，因此在食品和医药领域的应用具有较高的安全性。
适合表达分泌型蛋白：具有良好的分泌表达系统，能够将表达的蛋白分泌到细胞外，便于蛋白的提取和纯化，并且分泌的蛋白通常具有较好的稳定性。
可进行食品级表达：在食品工业中，乳酸菌可以作为一种食品级的表达宿主，用于生产食品添加剂、酶制剂等，不需要进行复杂的下游处理和去除内毒素等步骤。
缺点：
表达水平有限：乳酸菌的蛋白表达水平相对较低，对于需要大量生产蛋白的实验可能不太适用。
培养条件苛刻：乳酸菌对培养条件有一定的要求，如需要特定的培养基和培养温度等，这增加了实验的操作难度和成本。
4. 沙门氏菌（Salmonella）：
优点：
免疫原性强：作为一种病原菌，沙门氏菌具有较强的免疫原性，表达的蛋白可以作为疫苗的候选抗原，用于疫苗的研发和生产。
能够表达一些在真核环境中难以表达的蛋白：对于一些在真核细胞中难以表达的蛋白，沙门氏菌可能具有一定的优势，能够实现这些蛋白的表达。
缺点：
安全性问题：沙门氏菌是一种病原菌，在操作过程中需要严格的安全防护措施，以防止细菌的泄漏和感染，这增加了实验的风险和难度。
表达系统复杂：沙门氏菌的表达系统相对较为复杂，需要对细菌的生长和表达条件进行精确的控制，否则可能会影响蛋白的表达效率和质量。
5. 蓝细菌（Cyanobacteria）：
优点：
光合作用能力：蓝细菌具有光合作用能力，能够利用光能进行生长和代谢，因此在培养过程中不需要添加有机碳源，降低了培养成本，并且对环境友好。
易于基因操作：随着基因工程技术的发展，蓝细菌的基因操作技术也逐渐成熟，能够方便地进行外源基因的导入和表达调控。
可大规模培养：可以在光生物反应器中进行大规模培养，具有较高的生产潜力，适用于大规模生产重组蛋白。
缺点：
生长速度较慢：与大肠杆菌等细菌相比，蓝细菌的生长速度较慢，这可能会影响蛋白的生产效率。
蛋白表达量不稳定：蓝细菌的蛋白表达量受到多种因素的影响，如光照强度、温度、营养条件等，因此蛋白表达量的稳定性较差，需要对培养条件进行优化和控制。
宿主菌选择的考虑因素
1. 蛋白表达量：
如果需要大量表达目标蛋白，例如用于大规模生产或需要高产量的实验，可选择具有高拷贝数质粒且蛋白表达能力强的菌株，如大肠杆菌 BL21 (DE3) 系列。这些菌株经过改造，能够高效表达外源基因，适合对表达量要求较高的情况。
对于一些对表达量要求不高，但需要精确控制表达水平的实验，例如研究蛋白的功能或进行结构分析，可能需要选择表达水平相对较低但可调控性较强的菌株，如带有严谨调控系统的菌株。
2. 蛋白的特性：
蛋白大小：对于小到中等大小的蛋白，大多数原核宿主菌都能较好地表达。但如果是较大的蛋白（如分子量超过 100 kDa），可能需要选择具有特殊机制来帮助蛋白正确折叠和组装的宿主菌，比如一些能够增强分子伴侣表达的菌株，以提高大蛋白的表达效率和正确折叠。
是否含特殊结构或修饰：如果目标蛋白需要形成二硫键以获得正确的折叠和活性，那么应选择有利于二硫键形成的菌株，如 K-12 衍生菌 Origami2 系列等。这些菌株的细胞质是相对氧化的环境，可以促进二硫键的形成，能够提高蛋白的可溶性及活性。如果蛋白需要进行糖基化等特殊修饰，原核宿主菌一般不能满足需求，需要选择真核表达系统，但在一些研究中，如果只是需要初步验证蛋白的功能，原核表达系统也可以作为一种选择，不过要注意蛋白的修饰情况可能与天然状态不同。
3. 宿主菌的遗传特性：
密码子偏好性：真核细胞和原核细胞的密码子偏好性有所不同，当用原核系统表达真核基因时，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。此时，可以选择携带稀有密码子对应 tRNA 的宿主菌，如 Rosetta 系列菌株，能够补充大肠杆菌缺乏的稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
蛋白酶特性：有些宿主菌内源的蛋白酶过多，可能会降解外源表达产物，导致蛋白不稳定。因此，对于容易被蛋白酶降解的蛋白，应选择蛋白酶缺陷型菌株作为宿主菌，如 BL21 系列就是 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型，是比较理想的起始表达菌株。
基因的兼容性：要确保宿主菌的基因组与外源基因的兼容性，避免出现基因沉默、不兼容等问题。例如，某些宿主菌可能对特定的 DNA 序列或基因结构存在排斥或不识别的情况，在选择宿主菌时需要考虑这一点。
4. 安全性和生物相容性：
内毒素的产生：如果表达的蛋白用于医疗或生物制品等对安全性要求较高的领域，需要考虑宿主菌产生内毒素的情况。大肠杆菌通常会产生内毒素，而一些其他的原核宿主菌，如乳酸杆菌，不产生内毒素，对于生物安全性要求较高的蛋白质表达适用。
宿主菌的致病性：某些原核宿主菌具有致病性，在实验操作和后续应用中可能存在安全风险，需要谨慎选择。例如，伤寒沙门氏菌虽然可以用于蛋白表达，但处理要求更为复杂，相对较少被使用。
5. 培养条件和生长特性：
培养成本和难度：一些宿主菌的培养条件较为简单，生长速度快，培养成本低，如大肠杆菌，易于在实验室中进行大规模培养和操作；而有些菌株可能需要特殊的培养基或培养条件，增加了实验的成本和难度。在选择宿主菌时，需要考虑实验室的培养条件和成本预算。
生长速度：对于需要快速获得蛋白的实验，选择生长速度快的宿主菌可以缩短实验周期。一般来说，大肠杆菌等常见的原核宿主菌生长速度较快，能够在较短时间内达到较高的细胞密度，有利于蛋白的表达。
6. 与表达载体的兼容性：
抗生素抗性：表达载体通常携带抗生素抗性基因，用于筛选转化成功的宿主菌。在选择宿主菌时，要确保其抗生素抗性与表达载体相匹配，例如，如果表达载体携带氨苄青霉素抗性基因，那么宿主菌应具有对氨苄青霉素的敏感性，以便通过添加氨苄青霉素来筛选阳性克隆。同时，也要注意一些宿主菌可能本身已经携带某种抗生素抗性，避免使用相同的抗生素进行筛选。
启动子的兼容性：不同的表达载体可能使用不同的启动子，而宿主菌需要具有与启动子相匹配的转录机制才能实现基因的有效表达。例如，某些表达载体使用 T7 启动子，就需要选择含有 T7 RNA 聚合酶的宿主菌，如 BL21 (DE3) 等。
逐典生物定制化原核蛋白表达服务
上海逐典生物的科学家团队在定制原核蛋白领域潜心钻研十余年，积累了极为丰富的分子设计、蛋白筛选以及工艺开发经验。迄今，已成功交付了数百种细胞因子和定制酶。逐典生物定制化原核蛋白表达服务以先进的技术平台为支撑，其中人工智能驱动的分子设计平台，可对蛋白的结构与功能进行优化设计，从而显著提高蛋白的表达效率与活性；高通量蛋白制备平台能够快速支持蛋白的表达和筛选，充分满足客户需求；此外，还有独特的包涵体变复性平台，有效解决了原核表达蛋白因错误折叠而形成包涵体这一痛点问题。
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【关于逐典】
上海逐典生物科技有限公司，坐落于中国（上海）自由贸易试验区，获得ISO9001质量体系认证，是一家从事重组蛋白研发和销售的高新科技企业。
逐典生物始终秉持以客户为中心的理念，针对重组蛋白的结构设计、纯化工艺及其稳定剂型相关的多项关键技术进行优化。专业定向蛋白变复性技术，可将大肠杆菌大量表达的变性固体蛋白转变成高活性可溶性蛋白。凭借技术优势，逐典生物新品研发周期短且可控性强，为重组蛋白的高质高效研发提供保障，为企业生产降本增效。
公司自成立以来成功开发百余种高活性细胞因子及多种高活性蛋白酶，覆盖细胞培养、病毒纯化以及质量分析等生物工艺各个环节。可广泛应用于科研、医药生产及IVD（体外诊断试剂）等领域，满足各类用户所需。
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