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突破瓶颈！人源多能性干细胞培养技术新进展
文章来源： ：SinoTalk为承诺发声，作者：中新小鱼
人源多能性干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，包括从体内胚胎分离获得的胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)和体外诱导获得的多能性干细胞(Human Induced Pluripotent Stem Cells, hiPSCs)。人源干细胞是进行细胞多能性维持机理研究、体细胞重编程机制研究和疾病发病机制研究等基础研究的重要研究对象。同时，人源干细胞也作为遗传性疾病治疗药物筛选、体外器官构建的“种子”细胞，在疾病治疗和再生医学治疗中具有重要价值。
尽管已经经过几十年的发展，人源干细胞的培养技术还有待完善。人源干细胞培养过程中的一个重大技术瓶颈是人源干细胞在传代，单细胞克隆和冻存复苏过程中容易凋亡，导致其存活率非常低。这个技术难题对人源干细胞的培养，基因编辑，以及人源干细胞产品的冻存复苏都造成巨大的困难。日本科学家Kiichi Watanabe和Yoshiki Sasai在2009年率先发现Rho-associated Kinase（ROCK）的抑制剂Y-27632可以有效抑制人源干细胞在传代过程中的细胞凋亡。Y-27632的发现极大地优化了人源干细胞的培养流程，目前已经被广泛运用。然而，Y-27632并未能彻底解决人源干细胞凋亡的问题。目前，即使在使用Y-27632的条件下，人源干细胞在单细胞克隆，以及冻存复苏过程中依然面临存活极低的困难。这个技术瓶颈在过去十多年中一直困扰着人源干细胞在基因编辑中的运用以及干细胞产品高效冻存复苏的实现.
2021年5月3日， 美国国立卫生研究院转化医学研究中心干细胞转化实验室的陈宇博士，陈璐博士和邓涛博士等在Nature Methods上发表论文A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells，首次报道了一个显著提升人源干细胞在单细胞克隆和冻存复苏过程中的存活率的四组分配方 CEPT（Chroman1， Emricasan， polyamines 和trans-ISRIB）。CEPT通过同时阻断多个诱发人源干细胞凋亡的信号通路，实现了显著提升人源干细胞在多种极端条件下的存活率。
图1. 干细胞存活筛选示意图。
论文作者首先发展了监测人源干细胞存活的药物高通量筛选实验体系，然后通过药物高通量筛选平台测试了15333个化合物。在他们发现的113个具有活性的化合物中，Chroman1是一个非常有效的ROCK抑制剂。它比目前广泛使用的Y-27632对ROCK的抑制更加有效，同时选择性更好。
图2. 干细胞存活组合筛选示发现Chroman1和Emricasan
随后，作者从113个有活性的化合物中挑选了29个代表不同作用机制的化合物进行了组合筛选（Matrix Screen）。通过测试812个组合，作者发现Chroman1和Caspase抑制剂Emricasan有明显的协同作用。同时使用Chroman1和Emricasan可以显著减少人源干细胞在细胞传代过程中的凋亡。
图3. 干细胞存活三个化合物的组合筛选示发现Chroman1+Emricasan+tISRIB
人源干细胞存活的极限挑战是单细胞克隆。在这个流程中，通过流式细胞仪每一个干细胞被单独放到96孔细胞培养板的一个孔中，让其成长为一个新的单细胞克隆。在目前的干细胞培养方法下，单个干细胞能够成功成长为单细胞克隆的机会非常小。这常常成为干细胞基因编辑的路障。在发现Chroman1和Emricasan（C+E）的协同作用后，作者在干细胞单细胞克隆实验中测试了C+E的效果。作者吃惊的发现C+E并不能够提高干细胞单细胞克隆的效率。这个结果让作者认识到干细胞在单细胞克隆过程中面临着细胞低密度条件下特殊的生存压力。为了寻找能够缓解这种特殊压力的化合物，作者进一步发展了在低细胞密度下进行药物高通量筛选的实验体系。通过在低细胞密度下进行第三轮药物高通量筛选，作者非常幸运地发现tISRIB可以显著增加干细胞在低密度条件下的存活率。tISRIB 是University of California, San Francisco (UCSF) Peter Walter实验室研发的Integrated Stress Response的抑制剂。因此，这一研究发现表明Integrated Stress Response在干细胞的存活中有着重要作用。同时，通过测试多种细胞培养添加组分作者也发现polyamines也可以促进干细胞在单细胞克隆过程中的存活。最终，作者发现同时使用Chroman1, Emricasan, polyamines, 和tISRIB（CEPT）可以将干细胞的单细胞克隆率提升到40%以上。
在提升了人源干细胞的单细胞克隆效率之后，作者测试了CEPT在干细胞培养中的其他运用。他们发现CEPT不仅可以减少干细胞在形成EB过程中的凋亡，而且可以促进EB和微器官的生长和分化。同时，CEPT也可以极大的减少干细胞以及干细胞产品在冻存复苏过程中的凋亡。因此，CEPT在人源干细胞的基础研究和临床运用中都有广阔的运用前景。
图4. CEPT促进干细胞在Embryoid body和冻存复苏过程中的存活
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