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脂质纳米颗粒LNPs参与CAR T细胞疗法的进展
文件来源：SinoTalk津津乐道，作者：王哲新
CAR T细胞疗法在难治性或复发性（R/R）血液系统恶性肿瘤中可以显示出持久的反应。例如，CAR T细胞疗法在B细胞急性淋巴细胞性白血病（ALL）、B细胞淋巴瘤和B细胞成熟抗原（BCMA）治疗多发性骨髓瘤方面显示出积极的临床成果。然而CAR T细胞也存在一定的缺点，如有限的T细胞迁移、免疫抑制环境和抗原逃逸。此外，CAR T细胞疗法还与一些潜在的副作用相关，例如细胞因子释放综合征和神经毒性。
临床制造过程涉及多个体外阶段，包括从外周血单个核细胞中收集和分离T细胞，然后激活。这一过程持续1-2周，从而影响和塑造临床前结果。关键阶段是遗传修改过程，通过病毒或非病毒转导实现，促进DNA或mRNA的整合。尽管当前市场上批准的CAR T细胞和临床研究的主要焦点都使用病毒载体（γ-逆转录病毒和慢病毒）来传递CAR基因，但值得注意的是，病毒载体生产的复杂性和成本带来了相当大的挑战。为了追求更可持续和成本效益的方法，非病毒方法，如mRNA技术和转座子，已经进入了最初的概念验证临床试验。然而，通过集中的研究工作来增强这些替代方法的持久性和安全性至关重要。
在解决CAR T细胞疗法固有的挑战，特别是毒性方面时，非病毒转导方法正在被开发。如脂质纳米颗粒（LNPs），正在被探索以减轻毒性并增强CAR T细胞的安全性。在这篇综述中，作者团队提供了LNP介导的CAR构建物传递的优势和机制的深入分析，以改善持久性、功效和减轻毒性。此外，揭示了LNPs与CAR T细胞之间的相互作用、当前的挑战和可能的解决方案。
图1A展示了不同代CAR的结构和功能，其中第一代CAR依赖于ITAM基序进行T细胞激活，第二代CAR增加了CD28或CD137共刺激域以增强增殖和细胞毒性，第三代CAR结合了CD137或CD134以激活NF-κB和MAPK途径，促进T细胞生存和记忆形成，第四代CAR能够分泌细胞因子，直接促进肿瘤杀伤，而第五代CAR在第二代的基础上加入了IL2受体β链，通过STAT3激活提供抗原特异性激活，增强T细胞的效应功能和记忆细胞形成。图1B描述了LNPs的组成和功能，其中包括带正电的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇以及PEG化脂质，它们共同作用以保护mRNA CAR构建物，提高其稳定性和循环时间，并通过靶向配体提高对目标细胞的选择性，减少脱靶毒性，从而有效地将治疗性mRNA传递到目标细胞中。
图2中展示了病毒载体在基因治疗中的局限性，特别是腺病毒和慢病毒载体的尺寸限制（直径≤100纳米），这限制了它们携带的基因盒大小不能超过8-9千碱基对。这种尺寸限制使得使用单独的病毒载体传递两个不同的转基因变得具有挑战性。此外，插入性突变的风险也引起了关注，因为在CAR T细胞工程中可能会发生致癌插入。第三，病毒载体的使用伴随着固有的免疫原性风险，这可能会激发宿主的免疫反应，但通过过度表达CD47可以抑制这种免疫原性。
因此，这些限制促使研究趋势转向非病毒方法进行基因传递，寻求能够克服病毒载体挑战的替代方案。非病毒方法，如电穿孔和脂质转染，提供了一个更安全、更灵活的平台，用于在没有病毒衣壳尺寸限制的情况下传递基因。特别是脂质纳米颗粒（LNPs），因其高效的封装和传递含有CAR构建体的mRNA到目标细胞的能力，成为了一个突出的探索领域。LNPs不仅规避了病毒载体的尺寸限制，还解决了插入性突变和免疫原性的问题，使得它们在CAR T细胞治疗中具有降低毒性、提高安全性和降低成本的潜力。
图片3展示了脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种多功能药物递送平台的潜力和优势。LNPs能够封装较大的遗传物质有效载荷，有助于传递复杂的基因盒，这在病毒载体中可能是具有挑战性的。与传统的病毒载体相比，LNPs不包含病毒蛋白，因此具有更低的免疫原性，能够保护RNA免受核酸酶、细胞因子和插入性突变的影响。LNPs的纳米尺寸和组成有助于提高生物相容性，并减少免疫反应。此外，LNPs提供了一个可定制的平台，允许为特定的基因递送需求定制脂质组成，从而提高递送效率和细胞特异性。LNPs在生物流体中的稳定性有助于保护遗传物质的有效载荷，确保递送效率。某些LNPs可以被设计为针对特定细胞的靶向，增强了基因递送的精确性。LNPs的可扩展性和可复制性支持从研究到临床应用的转化。因此，LNPs在药物递送领域的潜力不仅限于基因递送，还包括广泛的应用，如精确的蛋白质表达、针对肝脏的转基因递送、简化的CAR T细胞生产、改进的mRNA递送，以及有前景的非阳离子硫脲LNPs，这些都需要进一步的安全性和可扩展性研究。
图4展示了脂质纳米颗粒（LNPs）在CAR T细胞治疗中用于核酸递送的合成和配方过程。这个过程开始于由脂质、胆固醇和聚乙二醇化（PEGylated）脂质组成的LNPs的自组装，它们通过静电、氢键和疏水相互作用封装核酸。稳定剂如PEG增强了LNPs的稳定性。细胞内摄取涉及由细胞表面受体促进的内吞作用。内体逃逸和细胞质释放对于递送核酸、实现翻译和生物活性至关重要。LNPs传统上针对肝细胞进行mRNA递送，但最近的进步使LNPs能够有效地将mRNA递送到非肝细胞，扩大了治疗目标范围。在不依赖于ApoE和LDL受体的途径上取得的进展增强了LNPs针对不同细胞类型的多样性。图片还展示了两种脂质成分1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）的结构。通过优化LNPs配方，可以实现对T细胞的高效mRNA递送，这为传统方法提供了一种替代方案，最小化了与病毒载体基因转染相关的致瘤风险。此外，对LNPs结构-功能关系及其与ApoE的相互作用的理解不断深入，为特定治疗应用量身定制LNPs提供了基础，从而推动了基于核酸的治疗药物的发展。LNPs的持续发展对于克服包括肝外递送和慢转染在内的递送挑战具有巨大潜力，有助于提高CAR T细胞治疗的疗效和持久性。进一步优化LNPs配方以增强对特定细胞类型的递送，包括T细胞，并提高瞬时基因表达的效率是必要的。
脂质纳米颗粒（LNPs）在CAR T细胞治疗中显示出作为病毒载体和电穿孔技术的替代方法的潜力，未来将更多的用于工程化CAR T细胞。但在应用之前，需要考虑多个方面，包括免疫原性、核酸类型、降低毒性和提高安全性、可扩展性以及临床适用性等。最近的研究正在逐步推进LNPs在这些方面的应用。例如，LNPs能够通过将治疗性mRNA运送到淋巴细胞来实现CAR T细胞的体内生产，确保了高效的递送、较低的免疫原性以及降低了插入性突变的风险。LNPs的可扩展性，加上快速优化、无需复杂的生产要求和临床适用性，进一步使它们成为CAR T细胞工程的可行选择。
目前临床应用中工程化CAR T细胞的方法主要采用病毒载体，导致CAR永久表达并可能产生严重的负面影响。 作为应对这些挑战的解决方案，通过递送mRNA在T细胞中短暂表达CAR已成为一种有前途的策略，脂质纳米颗粒（LNPs）作为非病毒载体，展现出了高效、低免疫原性和安全性的优势。LNPs能够共递送mRNA和siRNA，增强T细胞的CAR表达和PD-1敲低。此外，LNPs的结构和组成对其在体内的分布、细胞摄取和免疫反应有重要影响。研究表明，LNPs的PEG化程度、离子化脂质的使用以及与ApoE的相互作用都会影响其在体内的稳定性和递送效率。
图5中的内容描述了脂质纳米颗粒（LNPs）的聚乙二醇化（PEGylation）对其功能的影响。LNPs的大小和PEG的构象，如蘑菇状、刷状，影响其表面电荷和与血浆蛋白的吸附，进而影响基因沉默的能力。刷状PEGylation的LNPs在静脉注射后显示出比蘑菇状或俱乐部状PEGylation的LNPs更强的血浆蛋白吸附能力。此外，PEGylation的程度也影响LNPs的大小、表面电荷和基因沉默的能力。轻微PEGylated的LNPs在肿瘤驻留的抗原呈递细胞（APCs）的激活和扩增方面表现出增强的效果，而高度PEGylated的LNPs则效果减弱。这些发现对于理解LNPs在CAR T细胞治疗中的整合、优化mRNA基CAR T细胞工程策略以及提高治疗的精确度和多功能性具有重要意义。
基于LNPs的特质，LNP具有在体内产生CAR T细胞的能力，为直接在患者体内产生CAR T细胞的全身应用提供了机会。由于mRNA仅在细胞质中表达，不会整合到基因组中，且在细胞分裂时会被稀释，因此使用LNPs生成的CAR T细胞是短暂的。这一特性有助于限制长期治疗中的非靶向效应和毒性。与传统的体外T细胞处理方法相比，LNPs提供了一种替代策略，通过体外mRNA传递到T细胞，有效降低了细胞毒性，同时实现了与电穿孔相当的CAR表达。LNPs还被用于体外mRNA转染，成功地工程化了CAR巨噬细胞和CAR T细胞，展示了LNPs在成本效益和安全性方面用于mRNA基础的过继细胞疗法的潜力。研究还探索了替代传递方法，以解决持续表达可能带来的问题，如通过一步传递CRISPR-Cas9组分实现hiPSCs的瞬时表达，以及筛选和优化脂质体库以实现mRNA在原代T淋巴细胞中的高效转染。这些研究共同强调了LNPs在瞬时CAR T细胞生成中的潜力，并为癌症免疫疗法的进步提供了新的解决方案，如体内mRNA传递、对耐药T细胞的高效转染以及控制粒子工程以提高安全性和有效性。
与电穿孔相比，LNP在降低T细胞毒性同时保持相当水平的CAR表面表达方面显示出前景，展现出在mRNA基CAR T细胞工程中降低毒性和提高安全性的潜力。尽管在体外基因编辑T细胞和造血干/祖细胞（HSPCs）方面存在挑战，但通过LNPs传递核酸酶RNA能显著减少细胞死亡、改善细胞生长，并增强T细胞的耐受性。LNPs还被证明在原代T细胞中具有提高转染效率和选择性脾脏趋向性，以及在体外成功创建了一种LNP平台，用于向CD4+ T细胞高效传递Foxp3 mRNA，产生具有瞬时表型的免疫抑制T细胞。通过将特定抗体修饰整合到LNPs中，可以精确地向T细胞靶向和传递mRNA，这不仅增强了mRNA的靶向传递，还有助于降低毒性和提高安全性。尽管如此，将这些发现转化为可行且安全的CAR T细胞疗法的一个关键方面是，需要研究LNPs在不同治疗环境中的长期效应和临床适用性。
除了以上的优势，LNPs介导的mRNA递送在CAR T细胞治疗中也面临多种障碍，包括给药途径、生理屏障和设计特异性，这些都影响了精准靶向的实现。基因转染相关的挑战尤为突出，因为免疫细胞对LNPs的摄取效率低，mRNA在LNPs内的稳定性和降解问题，以及供应链问题，都需要专门的策略来实现高效和靶向的基因递送。研究显示，LNPs的化学结构、配方优化、非淋巴器官中的非期望表达和免疫原性限制了T细胞的转染效率。即使LNPs被细胞摄取，也不一定能成功实现基因递送，因为与HeLa细胞相比，人类T细胞的内体酸化过程较慢且不够强大。因此，未来的研究不应完全依赖于pH触发的释放机制来实现成功的转染。LNPs的大小、动态膜特性和细胞内环境给T细胞的转染带来了挑战。
为了解决这些挑战，研究者们正在开发专门针对免疫细胞转染的LNPs，优化配方以增强mRNA表达并最小化免疫原性，并探索创新的靶向递送方法，以减少非靶向效应。研究者们也在探索替代基因递送机制，以应对人类T细胞内体酸化速度慢和细胞大小及膜动态性的挑战。改进靶向策略，以提高目标免疫细胞的特异性和摄取效率，同时最小化非目标细胞如巨噬细胞和树突细胞的摄取，对于扩大LNPs介导的mRNA递送在免疫相关疾病的应用至关重要。给药途径和器官分布障碍也是纳米粒子达到目标的重要挑战，需要深入了解LNPs在体内的分布情况，以便有效给药。
尽管LNPs在系统给药后能够通过血液循环到达其他器官和组织，但是它们的尺寸、表面修饰和给药途径等因素都会影响其在体内的分布和疗效。因此，需要进一步的研究来优化LNPs的配方，以提高其在CAR T细胞治疗中的持久性和有效性。相信随着研究的深入，LNPs将会带来CAR T细胞疗法的新时代。
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