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神经损伤后的干细胞治疗
原创: 彪彪 文章来源于：生物制品圈
摘要：轴突退化、炎症、神经元死亡和细胞架构扭曲可能导致中枢和周围神经系统的神经损伤，如外伤、医源性事件和神经退行性疾病。由于缺乏前体细胞，成年哺乳动物神经系统的再生能力受到限制。干细胞自我更新和分化成多种细胞类型的能力为解决这些障碍以改善神经再生提供了新的治疗潜力。迄今为止，干细胞治疗在神经系统再生中的潜在益处已受到关注。已有报道称干细胞可治疗缺血性脑损伤、周围神经损伤（PNI）和疼痛。干细胞可转化为新的神经元和其他支持细胞以改善神经再生并恢复功能。除了神经营养因子外，有效的再生还涉及神经元与不同细胞外基质支持细胞之间的联系。要被视为临床上有效的治疗选择，必须解决有限的供体来源、不可控的细胞成熟、低细胞存活率和低植入率等问题。本章提供了关于在中枢和周围神经系统的神经疾病中应用干细胞的研究综述，主要是心脏骤停（CA）引起的全球性缺血性脑损伤和基于细胞的治疗在PNI中的应用。本章描述了CA和PNI模型的建立，评估了使用不同类型的干细胞和输送方法后增强的结果，介绍了用于进一步改善干细胞治疗的技术，并为干细胞治疗在神经疾病中的前景提供了未来展望。
1.引言神经元或/和胶质细胞的破坏是中枢神经系统的全脑缺血和周围神经系统的周围神经损伤等常见神经系统疾病的首要病理机制。近年来，干细胞治疗作为一种新颖的替代策略，有望在神经损伤后恢复神经功能。临床前研究表明，干细胞移植通过调节神经炎症和增强缺血性脑损伤后内源性神经干细胞（NSCs）的神经发生来改善神经学结果。干细胞治疗已被报道可减少神经病理性疼痛，促进轴突再生和髓鞘再生，并最终增强神经修复。几项临床研究表明干细胞在神经损伤患者中的安全性和有效性。本章概述了干细胞治疗在神经损伤中的应用，包括心脏骤停（CA）引起的脑缺血损伤和PNI。我们首先简要介绍CA和PNI后干细胞输送方法和损伤模型，然后总结干细胞治疗对CA和PNI的有益效果。
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2. 心脏骤停引起的全脑缺血性脑损伤中的干细胞治疗心脏骤停引起的全脑缺血性脑损伤是危重病医学中神经功能障碍的主要原因。心脏骤停后的脑损伤由脑暴露于缺血时的原发性损伤和随后再灌注期间的继发性损伤组成。在美国，每年大约有380,000例院外心脏骤停病例和290,000例院内心脏骤停病例。尽管神经保护药物和目标温度管理取得了进展，许多幸存者仍在与持续的残疾作斗争。需要新的治疗方法来替代受损的神经元以恢复神经功能。实现有效的脑复苏以挽救缺血性神经元和加速受损神经组织的修复以改善脑功能恢复已成为全球挑战。干细胞治疗因其扩大修复效率和增强细胞分化的潜力而代表一种新的治疗方法。干细胞移植通过包括神经发生诱导、血管新生、细胞替代、轴突可塑性、髓鞘再生和神经炎症调节等潜在机制修复中风后的局灶性缺血性脑损伤。在中风患者中也报告了干细胞治疗的治疗效果。然而，全脑缺血性脑损伤中的干细胞治疗报道较少。本节提供了在啮齿动物CA模型中干细胞治疗的概述，包括窒息CA模型、输送途径（脑内室（ICV）和鼻内给药）以及干细胞治疗后的神经学结果。2.1.心脏骤停和复苏的实验模型实验性CA模型包括电极植入、插管、插管和窒息CA。在异氟醚麻醉下使用立体定向装置植入螺钉电极。记录电极的位置分别是Bregma侧1.5毫米、尾端2.0毫米和侧3.0毫米、尾端1.5毫米。为了最小化噪声，一个参考电极被放置在Bregma侧1.5毫米、尾端1.4毫米。所有电极仅与硬脑膜轻轻接触，并未穿透脑实质。在CA当天，麻醉动物被保持仰卧位，并使用14号气管插管在喉镜下插管至预定长度。气管插管通过缝合固定在脸颊上，以防止移位和滑脱。混合氧、氮和异氟醚的呼吸机支持大鼠。使用股动脉导管监测平均血压（MAP）并收集血液进行动脉血气（ABG）测试。在窒息CA前通过静脉给予维库溴铵使大鼠瘫痪。通过关闭呼吸机和夹住气管插管来诱导全脑窒息。MAP <10 mmHg、无脉动压力波或心电静止活动被定义为CA。通过解开气管插管、重新启动呼吸机、通过股静脉给予肾上腺素和碳酸氢钠以及持续的心肺复苏（CPR）来开始复苏。通过使MAP >60 mmHg，实现了自主循环恢复（ROSC）。根据ABG结果，相应调整呼吸参数，如呼吸频率、潮气量和/或正压呼气末压力（PEEP），以保持PCO2在35至45 mmHg之间。连续监测脑电图（EEG）、心电图（ECG）、血压和温度。使用加热垫将温度控制在36.5-37.5°C。2.2.心脏骤停后干细胞治疗的输送方法输送干细胞的途径包括静脉注射（IV）、动脉内注射（IA）、脑室内（ICV）给药、鼻内给药、颅内（IC）注射和腹腔内（IP）给药。通过IV给药将干细胞输送到大脑的能力是有限的，一些细胞会积聚在外围器官，如肺、肝、脾和肾脏。在人类中，通过静脉注射的脂肪组织源干细胞治疗中已有肺栓塞的报道。通过IA给药绕过系统组织的摄取，以避免肺栓塞的风险。然而，当细胞在脑动脉中聚集时，可能导致脑缺血。通过IP途径给药的干细胞会被困在腹腔内，只有部分穿透大脑。IC给药能够在目标区域实现更高的细胞浓度。然而，由于其侵入性，可能会引起局部脑损伤。ICV给药通过脑脊液（CSF）扩散将干细胞输送到多个部位。鼻内给药是一种非侵入性方法，能够穿过血脑屏障（BBB）。在确定干细胞治疗的最佳输送技术时，必须考虑几个标准，包括实际可操作性、足够的BBB穿透、输送速度和特定靶向。本节讨论了心脏骤停后ICV和鼻内输送干细胞治疗的实验方法。2.2.1.心脏骤停后脑室内注射干细胞复苏后3小时，大鼠被放置在异氟醚麻醉下的立体定向装置中。通过1-1.5厘米的皮肤切口使头骨可见。使用高速钻头，在Bregma侧1.5毫米、尾端1.2毫米处钻ICV孔，深度为4毫米。干细胞被缓慢且连续地注入侧脑室，超过一分钟。针头至少保留一分钟以防止干细胞泄漏。然后逐渐拔出针头。2.2.2.心脏骤停后鼻内给药干细胞ROSC后3小时，通过每个鼻孔的滴管尖端给药干细胞，以提高渗透性并促进细胞进入大脑。干细胞在右鼻孔和左鼻孔各注入两次，每次给药间隔10分钟。每次给每个鼻孔注入10μl，直到总共注入40μl干细胞。2.3.心脏骤停后干细胞治疗的神经学评估持续的氧气和能量底物供应对大脑组织的健康至关重要，当脑血流中断时，大脑的功能就会受损。这部分总结了多种评估心脏骤停引起的缺血性脑损伤后干细胞给药神经恢复的方法。包括定量电生理分析的定量脑电图（qEEG）和体感诱发电位（SSEP）、神经功能缺损评分（NDS）和组织病理学检查在内的经过充分验证的系统评估被介绍。重点介绍了ICV和鼻内输送策略的治疗效果。动脉血气（ABG）结果基线时和ROSC后20分钟通过股动脉评估ABG测试，最多取0.05-0.1毫升血样。所有呼吸机设置根据复苏后的ABG结果相应调整。神经功能缺损评分和存活率临床检查、神经影像学和电生理测试是主要的神经生理预后措施。包括脑干反射在内的临床检查已整合到经过充分验证的NDS检查中，用于评估心脏骤停后的整体神经行为功能（图1）。NDS检查基于以下标准分配了80分的总分：整体行为功能障碍、脑干功能、运动和感觉评估、运动行为、简单行为反应和癫痫发作。高级运动功能范围为0至18。它使用子NDS分析进行评估，包括走平衡木、步态协调、翻正反射、负地理定位、视觉放置和转弯巷测试。在ROSC后6小时、24小时、48小时和72小时等多个时间点测试了聚合NDS和子NDS。记录了过早死亡动物的存活时间，并使用Kaplan-Meier分析分析了72小时存活率。
图 1 神经功能缺损评分（NDS）。NDS持续时间<60被定义为严重神经功能缺损（SND）的阈值。* 高级运动功能的子NDS电生理评估包括正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）在内的成像技术的进步，使得建立新的成像标志以预测心脏骤停后患者神经障碍的长期恢复成为可能。由于它们有限的分辨率和对实时信息获取的限制，迫切需要开发非侵入性技术以改善心脏骤停后功能结果预测。改进的电生理监测，重点关注脑电图和SSEP，可以帮助以更高的灵敏度和特异性评估整体神经功能损害的严重程度，并且可以方便地在床边进行。Jia的研究小组已经研究了多模态预后指标的有效性。脑电图是通过一系列电极获得的大脑电活动的记录。在CA前，脑电图被记录为5分钟的基线生理测量，并且在ROSC后的前6小时恢复期间进行了连续记录。定量脑电图描述了脑电图在一段时间内的数学属性。信息量化（IQ）是脑电图信号的一种新的定量测量方法，脑电图-IQ已被充分验证为预测心脏骤停后神经结果的良好指标。所有脑电图数据都被分析并以脑电图-IQ的定量形式导出，使用MATLAB的核心算法。所有数据都标准化到基线。在CA时脑电图波形几乎变平，脑电图-IQ值几乎降至零。随后，脑电图信号和脑电图-IQ值在复苏后逐渐恢复。SSEP对皮质和皮质下缺血敏感，并且比脑电图受镇静或低温的影响较小。在CA之后，SSEP能更好地识别预后不佳的患者，而不是预测良好结果。作为心脏骤停后预后不良的最准确的神经生理预测因子，SSEP已被Jia和其他研究小组广泛研究，以评估复苏后的神经结果。在临床前研究中，评估定量SSEP信号的新技术显示出预测CA后良好神经结果的希望。定量SSEP可以帮助确定治疗目标，并预测大脑在复苏后将如何恢复。除了当前临床治疗标准中的N20峰值缺失/存在之外，SSEP是无意识心脏骤停患者预后良好的最早预测因子之一。在心脏骤停引起的缺血性脑损伤后，SSEP中特征峰值的延长潜伏期和振幅降低表明了受损的神经传导性。组织病理学评估甲苯胺蓝染色用于识别海马CA后缺血性损伤的神经元。组织病理学损伤评分（HDS），定义为目标区域死亡或缺血性神经元的比例，被引入作为评估神经元损伤的定量指标。采用不同方法追踪移植的干细胞。PKH26，一种红色荧光染料，被选作预标记移植的NSCs作为特定的细胞追踪器。PKH26阳性NSCs主要分布在海马CA1和大脑皮层区域，28天后通过ICV递送途径的CA。其他研究使用人类核Ku-86来识别移植的人类NSCs的迁移。NSCs脑室内注射后72小时，Ku-86阳性细胞迁移并在CA大鼠的海马区域主要发现。内源性NSCs在齿状回（DG）和侧脑室下区（SVZ）区域丰富，可以在外来NSC治疗后被诱导增殖和迁移。鉴于SVZ和脑室接近，ICV给药可能更有效地激活SVZ细胞。因此，也评估了SVZ内源性NSCs增殖和迁移以增强神经发生的能力。2.3.1.用脑室内注射干细胞治疗CA诱导的缺血性脑损伤基线ABG结果和电生理评估CA前不同组大鼠的基线条件是可比的，包括呼吸（pH，PCO2，PO2，HCO3^-，基础过量和SO2）和器官灌注（乳酸）在内的基线ABG结果没有显著差异。电生理EEG-IQ评估显示，干细胞治疗组和非治疗组在ROSC后3小时内的EEG-IQ值相似，表明通过ICV给药的干细胞治疗前EEG所指示的神经恢复是相同的。神经功能缺损评分和存活率NDS评估显示，通过脑室内注射NSCs的干细胞治疗显著改善了CA后缺血性脑损伤的神经结果，表现为ROSC后NDS随时间逐渐增加，干细胞治疗组的NDS表现更好。ROSC后3小时ICV递送NSCs增强了神经功能的恢复，如更好的聚合NDS所示以及在ROSC后48小时和72小时的运动功能和行为的子NDS。Kaplan-Meier分析还显示了存活率的有利结果。ICV移植NSCs提高了CA后全脑缺血的存活率。组织病理学评估组织病理学评估显示，无论是NSC治疗组还是仅CA组，在CA后海马CA2和CA3区域都有高密度的受损缺血性神经元。在ROSC后3小时将2.0×10^5 NSCs注入侧脑室，保护了经历8分钟窒息CA的大鼠大脑中的神经元免受缺血。移植的NSCs显著降低了海马CA2区域的HDS。免疫荧光染色显示了移植NSCs的分化，神经发生的增强，以及干细胞治疗在CA中的神经保护涉及的潜在机制。ICV递送NSCs增加了SVZ内源性NSCs的增殖和迁移，以促进CA后的神经发生。NSC治疗在CA后上调了与Wnt/β-连环蛋白信号通路相关的蛋白质表达，这可能有助于干细胞治疗对神经恢复的治疗效果。ICV移植后28天，在海马和皮层中PKH26阳性和NeuN（神经元标记）阳性细胞的共定位验证了从移植NSCs到神经元的分化。2.3.2.用鼻内注射干细胞治疗CA诱导的缺血性脑损伤基线ABG结果不同组大鼠在CA前的基线条件相似。包括呼吸（pH，PCO2，PO2，HCO3^-，基础过量和SO2）和器官灌注（乳酸）在内的基线ABG结果没有显著差异。神经功能缺损评分Wang等人研究了鼻内递送NSCs在8分钟窒息CA大鼠中的疗效，并比较了NSC治疗和格列本脲（GBC）治疗的疗效。在ROSC后3小时鼻内递送0.4×10^6 NSCs显著改善了所有评估时间点（24小时，48小时和72小时）后的总体存活NDS。与GBC治疗相比，NSC治疗显示出更好的神经保护效果，如CA大鼠24小时后更好的NDS恢复所示。NSCs治疗的动物显示了严重神经功能缺损（SND）的持续时间缩短，定义为NDS<60的持续时间，表明通过鼻内途径在早期阶段的NSC治疗缩短了ROSC后严重条件的时间。干细胞治疗在外周神经损伤中的应用外周神经损伤（PNI）指的是对周围神经干或分支造成不同程度的损伤。PNI可能导致结构性损害，从而导致运动和感觉功能的局部或完全丧失、神经病理性疼痛和身体残疾，进而严重影响生活质量。PNI在神经系统疾病中很常见，据估计美国约有2000万人受影响。尽管显微外科技术取得了进展，修复神经损伤仍然是临床上难以解决的问题。雪旺细胞对神经再生至关重要。然而，获取雪旺细胞的侵入性质限制了基于雪旺细胞治疗的临床应用。干细胞作为具有众多再生优势的雪旺样细胞来源，已成为有希望的替代性基于细胞的治疗。干细胞分化成雪旺样细胞时，可以加速巨噬细胞的募集和坏死细胞碎片的吞噬。同时，干细胞分泌多种神经营养因子以增强轴突生长，包括神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。此外，干细胞治疗促进再生治疗中的再髓鞘化。在本节中，我们介绍了实验性PNI模型、干细胞递送途径、干细胞移植后的功能结果以及改进PNI干细胞治疗的策略。3.1.外周神经损伤的实验模型和干细胞移植周围神经病变可能由外伤引起。在临床前模型中，神经挤压和横断伤是最常用的模拟外伤性PNI的方法。此外，PNI可能导致神经病理性疼痛中的痛觉过敏和中枢敏化。其他主要关注神经病理性疼痛的PNI模型包括慢性背根神经节压迫（CCD）模型、慢性束缚伤（CCI）模型和胫神经及腓肠神经横断模型。这里，我们介绍了这些PNI模型以及PNI后干细胞的管理。3.1.1.神经挤压伤模型啮齿动物的神经挤压伤模型是模拟外伤性PNI的最常用方法之一，先前已有报道。简而言之，坐骨神经被小心暴露，然后被挤压10秒，每个间隔放松10秒，直到总挤压时间为30秒。干细胞直接管理在坐骨神经的挤压伤处。3.1.2.坐骨神经横断和修复模型完全坐骨神经横断是模拟患者严重外伤性PNI的典型严重PNI。坐骨神经横断伤和修复模型已经建立并描述得很好。简而言之，动物通过吸入氧气和异氟醚的混合物在面罩下麻醉。经过无菌准备后，腿部皮肤和肌肉被分层分离以暴露坐骨神经。为了产生超出周围神经系统有限再生能力的显著神经间隙，切除了坐骨神经分叉点近端0.5厘米处的15毫米长的坐骨神经，这是大鼠中的关键尺寸神经间隙。近端和远端神经残端各插入1毫米到17毫米长的神经导管中，使用9-0缝合线创建15毫米的缺陷距离。在显微镜下，神经残端在每侧使用9-0缝合线缝合。在坐骨神经横断手术期间，使用神经导向导管或自体神经残端修复坐骨神经间隙。干细胞直接递送到聚己内酯纳米纤维神经导管中。根据实验设计，将PBS注入导管或无细胞支架可作为对照组。3.1.3.复杂神经损伤模型复杂神经损伤模型是一种新颖的坐骨神经损伤和修复模型，模拟影响运动和感觉通路的复杂外伤性PNI。坐骨神经在其分叉点近端和远端0.5厘米处被切割1厘米长。在显微镜下，使用9-0缝合线将每个神经残端的神经外膜附着到每侧的神经支架上。远端运动通道缝合到腓肠肌的胫神经运动分支，远端感觉通道缝合到腓肠神经，近端通道缝合到坐骨神经。然后，皮肤和肌肉切口的各层被缝合在一起。干细胞直接递送到3D神经导管中。这种独特的损伤模型使得在复杂PNI后，无论是否管理干细胞，都能在运动和感觉上进行再生演变。3.1.4.背根神经节慢性压迫模型CCD是腰椎间盘突出症和根性疼痛的临床前PNI模型。CCD模型已经建立并报道了椎间孔狭窄的方法。在皮肤和肌肉无菌解剖后，L4和L5的横向过程和椎间孔可见。两个无菌不锈钢L形杆（4毫米长，直径0.63毫米）被插入L4和L5的孔中。在收集背根神经节（DRGs）时，验证了杆的正确位置。在CCI模型中采用了直接经皮注射细胞移植的方法。在异氟醚麻醉下，通过L4和L5之间的间隙推进带有干细胞的HAMILTON微量注射器到达蛛网膜下腔。在通过尾 flick确认针头位置在蛛网膜下腔后，谨慎且缓慢地注射干细胞。3.1.5.慢性束缚伤模型神经病理性疼痛的另一个常见PNI模型是通过单侧松散结扎坐骨神经的CCI模型。CCI模型通过在坐骨神经分叉近端松散地打四个3-0铬肠线结扎引起。结扎被仔细且缓慢地进行，以确保神经的直径可见且只有轻微的收缩。在CCI模型中，干细胞的局部应用直接靠近神经、IP注射或IV递送已被报道。3.1.6.胫神经和腓肠神经横断模型这种啮齿动物PNI模型通常涉及横断胫神经和/或腓肠神经以诱导机械性过敏。一旦分叉完全暴露并确认结构，就从它们的起源处2毫米的距离移除胫神经和腓肠神经各2毫米的片段。常见的腓总神经没有被触摸，保持完整。像在坐骨神经损伤和修复模型中管理的干细胞一样，使用含有干细胞的神经导向导管来修复神经间隙。3.2.周围神经损伤后干细胞治疗的系统评估3.2.1.电生理评估电生理记录在损伤前后均使用Tucker-Davis Technologies系统（TDT，Alachua，FL）通过前置放大器进行。记录针电极放置在远端坐骨神经或腓肠肌内。接地电极放置在动物尾部以最小化噪声。放置在神经近端的电极接受500 μA或1 mA的刺激，脉冲宽度为100 μs，频率为0.5 Hz。同时记录了胫骨前肌的电机诱发电位（MEP）和远端神经的复合电机动作电位（CMAP）。每个刺激重复四次，每次持续1分钟，间隔2分钟以供放松。记录在受伤和未受伤的两侧均进行。在MEP和CMAP中分别分析M波以及潜伏期和峰峰幅度。基于信噪比设置了一个阈值来检测峰值，该阈值是信号均值的两到三倍标准差以上。如果峰值低于此阈值，则被认为是噪声。Du等人研究了神经嵴干细胞（NCSC）治疗在周围神经损伤（PNI）后的治疗效果，在五个实验组中进行了研究，包括空白对照组、NCSC治疗组、电刺激（ES）组、基于体外研究的联合NCSC和优化ES治疗组以及自体神经移植组。优化的ES增强了2×10^6 NCSCs的治疗效果，提高了大鼠PNI后神经传导性。在NCSC治疗组和联合NCSC与优化ES组中观察到CAMP和MEP中更多的可检测信号，显示了干细胞治疗在坐骨神经横断和修复后神经再生的有益效果。在另一项利用大鼠坐骨神经损伤和修复模型的研究中，Du等人比较了移植5代（p5）或6代（p6）NCSCs后神经恢复情况，电生理评估表明，用5代NCSCs治疗的大鼠比用6代NCSCs治疗和未治疗动物有更好的可检测CMAP和MEP信号，从而验证了NCSCs在大鼠PNI后的效果，其中p5 NCSCs优于p6 NCSCs。
3.2.2.Catwalk步态分析Catwalk，一种步态分析工具，已在临床前研究中得到很好的建立，用于评估步态恢复。大鼠在手术前一周开始每天在Catwalk系统上训练，直到它们能够连续成功穿越走道三到五次而不停止。在测试当天，大鼠在走道上自由行走，并在走道上左右移动。当大鼠爪子接触走道的玻璃板时，照亮的接触区域被自动记录（图2）。每只大鼠总共完成三到五次连续、不间断的跑步。Catwalk系统自动从以下指标中收集两只后肢的数据：给定爪子的总打印区域（打印区域）、打印的平均压力（平均强度）、每步承重时间（站立时间）、每个步行周期中承重时间的百分比（占空比）、步间肢体速度（摆动速度）和步间距离（步幅长度）。对侧后爪被用作比较对照，以避免动物体重和步行速度的混杂效应。计算受伤同侧后肢与对侧健康后肢的比率，并调整到基线同侧/对侧比率。与对侧标准化的目标是减少因体重和跑步校准引起的方差。所有数据都转换为百分比，并由对侧的健康腿进行归一化。开发并采用了一种手动处理方法，用于错误校正，以确保正确分析并从Catwalk软件的自动分析中去除错误，以验证所有跑步。首先，任何未分类的脚印都被相应地分配到正确的肢体。其次，所有噪声信号，包括来自鼻子、尾巴、腹部和生殖器的信号，都被手动标记为“垃圾”。第三，被错误识别为属于多个爪子的单个脚印被更正为单个步骤。每个肢体需要至少两个步骤来计算动态数据，如占空比、摆动速度和步幅长度。少于两个步态周期的跑步不包括在分析中。在PNI后使用2×10^6 NCSCs的基于细胞的治疗改善了大鼠坐骨神经横断和修复模型的恢复结果。手术修复后，站立时间、摆动速度和平均强度从第6周逐渐增加到第12周。前肢强度从第2周至第6周的改善表明了PNI后运动功能的逐渐恢复。与非治疗组相比，NCSC治疗显著延长了站立时间，并在坐骨神经损伤后12周增加了主要强度。总体比较显示，NCSC组在手术后6周的占空比大于非治疗组。NCSC治疗在坐骨神经横断后2周和12周增加了步幅长度。NCSC移植与优化ES促进了大鼠坐骨神经横断和修复后的功能步态恢复，导致PNI后6周和12周的站立时间和占空比延长。步态分析表明，NCSC治疗组在坐骨神经损伤后12周显示出更协调的前肢和后肢脚印、更大的平均强度和更长的占空比。Catwalk分析还证实，用5代NCSCs治疗比6代NCSCs治疗有更优越的步态恢复。用NCSCs治疗PNI在步态分析中显示出有利的结果。与接受无细胞支架的大鼠相比，接受NCSC治疗的大鼠显示出更高的站立指数和最大强度。
图 2 Catwalk分析系统的代表性图片。(a) 大鼠从Catwalk XT系统的一端1.0米封闭走道移动到另一端。前肢和后肢的脚印都被自动捕获。(b-e) Catwalk系统中由“自动分类”功能引起的典型错误示例，以及手动校正和调整。(b) 检测到未分类的右后肢步态。通过指定适当的类别进行更正。(c) 由于垃圾颗粒被归类为步态，导致不准确的跑步分类。通过将垃圾颗粒识别为“JUNK”来修复错误。(d) 单个步态被分类为两个步态。合并步态以进行更正。(e) 动物改变方向并以前左后肢为支点向右转。通过移除受不良依从性影响的步态进行更正。3.2.3.痛觉相关行为测试痛觉行为测试，包括机械撤退阈值（MWT）和热撤退潜伏期（TWL），用于评估PNI后感觉功能的恢复。使用电子机械镇痛测试仪确定MWT。将玻璃箱放置在金属框架筛上。大鼠在实验前30分钟被放置在箱中以适应环境。电子机械刺激器的截止力设置为50克。测试针触碰大鼠后爪的内侧足底表面，直到表现出逃跑行为。快速撤退或爪子颤抖被视为阳性反应。每只大鼠进行三次测试，每次评估之间休息5分钟。每只动物的MWT计算为连续三次检查的平均值。使用自动热痛刺激器检测TWL。将玻璃箱放置在3毫米厚的玻璃板上，辐射灯在桌子下方。大鼠在实验前30分钟被放置在箱中以适应环境。在测试期间，刺激温度设置为45°C。使用光照射刺激下肢足底表面，直到发生撤退反应。当大鼠抬起或舔其后爪时，疼痛潜伏期的记录结束。为了防止组织损伤，设定了25秒的截止时间。每只大鼠进行了三轮测试，每轮间隔5分钟，所有三次测试结果的平均值被确定为此次测量的TWL。鞘内递送BMSCs显示出对CCD的机械痛觉过敏有强烈且短暂的缓解作用。CCD动物在MWT中表现出更长时间的爪子撤退和更多的舔舐行为。基于BMSCs的细胞治疗在治疗后1天显著减轻了这些痛觉过敏行为，表现为爪子撤退时间减少。外周递送NCSCs减轻了坐骨神经横断引起的疼痛。在PNI后12周观察到下肢足底表面的机械和热痛觉过敏。用外周给药的NCSCs在NWT和TWL测量中缓解了坐骨神经横断引起的疼痛。
3.2.4.修改的Wall评分自残行为是PNI后去神经支配肢体的常见行为，在啮齿动物模型中，特别是在坐骨神经损伤后的大鼠中，其发生率几乎达到40-80%。使用修改的Wall评分每周进行自残评估，以检查手术足自残行为。0分表示无自残。对于每个受影响的手指，指甲损伤给予1分，影响指骨的损伤给予2分，影响掌骨的损伤给予3分。修改的Wall评分范围从0到15分。PNI后严重自残被定义为修改的Wall评分超过4分。每周计算修改的Wall评分，以评估裸鼠和Wistar大鼠在接受NCSCs治疗后PNI的自残行为。总体而言，与Wistar大鼠相比，裸鼠在坐骨神经横断后表现出较少的自残行为。在坐骨神经横断损伤后2、4、6、9和12周，Wistar大鼠的Wall自残评分高于裸鼠，并且在Wistar大鼠中观察到更高频率的严重自残类型（修改的Wall评分≥4）。在第一周内，裸鼠和Wistar大鼠的自残发生率较低，随后从第2周至第6周急剧增加，并持续整个12周实验。
3.2.5.肌肉质量测量在PNI中坐骨神经横断后，神经肌肉支配被阻断，导致去神经支配的腓肠肌萎缩。肌肉质量测量是评估PNI后功能恢复的另一个重要指标。在安乐死后，仔细收集受伤和未受伤侧的腓肠肌，并记录肌肉重量。为了消除不同体重对绝对肌肉重量的混杂效应，应用腓肠肌指数（GMI）来评估PNI引起的萎缩后肌肉质量恢复的程度。GMI是通过将受伤侧的腓肠肌质量除以未受影响的对侧质量来计算的。在NCSC治疗组、自体移植治疗组和非治疗组之间，腓肠肌重量显示出不同的恢复。在6周和12周时，自体移植治疗的腓肠肌重量高于NCSC和仅导管非治疗组。与非治疗和仅ES治疗组相比，NCSC治疗和优化ES进一步减轻了肌肉萎缩，这两组在恢复12周后肌肉更小。NCSCs与优化ES的联合治疗在坐骨神经横断后6周和12周显示出最高的GMI。在非治疗组中，腓肠肌的纤维横截面积显示出形状不规则的小纤维。相比之下，NCSC组的腓肠肌显示出均匀分布的纤维直径和规则大小。给予5代NCSC或6代NCSCs减少了腓肠肌中的脂肪浸润和肌小节变性，显示出更健康的肌肉纤维。3.2.6.组织病理学评估甲苯胺蓝染色使核酸呈现蓝色，多糖呈现紫色。甲苯胺蓝染色的神经切片的组织形态可以用来定量分析干细胞治疗后的有髓纤维。在电子显微镜下检查髓鞘的外缘和内缘的长度，以定量分析纤维直径（FD）和轴突直径（AD）。根据纤维和轴突直径计算髓鞘厚度（髓鞘厚度 = FD - AD）。用2×10^6 NCSCs治疗促进了坐骨神经损伤和修复后的再髓鞘化。细胞计数分析显示，在神经修复后6周和12周，NCSC治疗组的有髓轴突更多。在另一项研究中，对照组再生神经组织在6周和12周时显示出稀疏或小片状，表明在横断后存在15毫米的神经间隙，再生不成功。经过NCSCs治疗后，有髓轴突数量增多，有髓轴突密度增强，轴突直径增加，髓鞘厚度增加。免疫荧光染色显示，人NCSC治疗在大鼠坐骨神经横断损伤模型中增强了神经再生，人NCAM（人细胞系标记）、微管蛋白（轴突标记）和S-100（施万细胞标记）的荧光信号更强。5代NCSCs的治疗效应优于6代NCSCs在坐骨神经损伤治疗中的效果。嘌呤受体P2X4（也称为P2X4R），是离子型ATP受体的一个亚型，被认为在痛觉过敏的发病机制中特别重要，通过免疫组化和Western blot在大鼠CCD模型中上调。体外，BMSC治疗后激活的小胶质细胞中P2X4R的表达水平下降。体内，鞘内注射BMSCs下调了脊髓小胶质细胞中P2X4R的表达，但不影响DRG神经元中TRPV4的表达。鞘内给药BMSCs在PNI后缓解疼痛的主要机制可能包括P2X4R的调节。3.3.提高周围神经损伤中干细胞治疗的效果3.3.1.联合治疗电刺激电场可以通过调节离子通道分布来增强细胞增殖、迁移和轴突生长。优化的电刺激（ES）在大鼠坐骨神经横断模型中进一步改善了NCSC治疗的神经保护效果。基于体外NCSCs形态变化和细胞分化改善，确定了优化的刺激参数（200 mV/mm强度和100 ms持续时间）。这种优化的ES促进了NCSCs的分化和增殖。微管蛋白免疫染色显示轴突再生的神经保护效果，NCSC+ES治疗比单独NCSC治疗更有效。NCSC+ES治疗还促进了有髓轴突密度、轴突直径和髓鞘厚度的增加，改善了神经传导性，减轻了肌肉萎缩，并加速了步态恢复。与NCSC治疗相比，NCSC与优化ES的联合治疗显示出更显著的治疗效果，表明优化的ES增强了大鼠坐骨神经损伤和修复后干细胞治疗的效果。
电针将MSCs和电针（EA）治疗结合起来治疗急性坐骨神经损伤，加速了髓鞘再生，增强了轴突延伸，并最终促进了PNI后大鼠的功能恢复。MRI监测显示，与PBS对照组相比，MSCs治疗组在3周和4周时神经水肿的减少更快。MSCs给药增加了MRI中的分数各向异性（FA）值，证明了受损神经中的轴突再生。联合治疗组在PNI后3、4和6周观察到最高的FA值。从组织学评估来看，联合治疗（MSCs+EA）显示出再生有髓纤维数量最多和近端髓鞘神经纤维直径最大。它改善了神经纤维连续性的恢复。
脉冲磁场脉冲磁场（PMF）增强了MSCs在CCI模型大鼠中的治疗效果。研究了MSCs治疗（时间依赖性 - PNI后1天或1周；途径依赖性 - 系统性或局部）的疗效、PMF及其联合治疗。2×10^6 MSCs的系统性给药和1×10^6直接在受损神经附近的局部注射均缓解了热痛觉过敏和机械痛觉过敏，表现为撤退潜伏期增加和平均阈值提高。与单独使用MSCs相比，使用MSCs和PMF的联合治疗显著增强了潜伏期和阈值。MSCs的治疗效果不受给药方法（IP与局部）或时间（通过IP在PNI后1天或1周）的显著影响。此外，在神经炎症调节中没有观察到时间依赖性差异。只有IP给药，而不是局部注射，的MSCs增强了抗炎细胞因子的表达，并抑制了促炎因子的表达。其他联合治疗粒细胞集落刺激因子（G-CSF），属于造血生长因子家族的蛋白质，被认为与造血前体细胞的存活、增殖和分化有关。一项研究表明G-CSF增强了移植MSCs对PNI的神经保护效果。局部注射MSCs到神经减轻了凋亡，增强了再髓鞘化，并改善了运动功能。G-CSF的IP给药抑制了压碎伤害介导的炎症细胞因子，减少了凋亡，增加了神经髓鞘化，并改善了功能恢复。在联合治疗组中，MSCs被输送到受损神经，随后G-CSF被注射到腹腔内，对周围神经再生产生了额外的有益效果。移植的MSCs中凋亡死亡的减少和炎症反应的抑制涉及协同效应。发酵大豆提取物（纳豆），作为一种传统饮食食品，可以促进循环中的纤溶活性，并通过抑制纤维蛋白沉积来抑制施万细胞的凋亡。在周围神经挤压伤的大鼠模型中，研究了间充质干细胞（MSCs）和纳豆的协同效应。MSCs、纳豆或联合疗法的给药改善了神经再生。纳豆减少了移植MSCs中的凋亡，并显著增加了神经丝早期再生标志物和S-100晚期标志物的表达，从而增强了MSC治疗的有益效果。纳豆还抑制了施万细胞的凋亡并下调了神经炎症。与单独使用MSCs或纳豆治疗相比，联合疗法产生了最显著的益处。3.3.2.生物材料：3D神经支架3D支架，一种3D打印方法，用于设计、优化和制造定制的神经修复支架，以促进周围神经损伤（PNI）中的再生。定制支架从3D解剖结构重建，提供轴突引导，有利于趋化功能。它为影响运动和感觉通路的复杂神经损伤提供了解决方案，并增强了组织再生。在大鼠坐骨神经横断模型中，使用无细胞或神经祖细胞（NCSC）负载的3D神经支架修复复杂的坐骨神经间隙损伤。坐骨神经修复后，NCSC负载的神经支架缓解了神经病理性疼痛，并增强了PNI后的运动功能恢复。NCSC负载的3D支架组显著减少了同侧后爪内侧掌面的机械和热性痛觉过敏。在3D支架治疗NCSC后，免疫荧光分析显示星形胶质细胞和小胶质细胞的激活减少。3.3.3.生物活性因子预处理Netrins是一类分泌蛋白，调节神经细胞的迁移和轴突引导，在神经发育期间。用过度表达的Netrin-1修饰MSCs促进了PNI大鼠模型的功能恢复。与MSC治疗相比，用预修饰的MSCs治疗在受伤后28天显示出更多的施万细胞。用Netrin-1预处理的MSCs给药后，BDNF和NGF的表达增加，并改善了坐骨神经损伤后的运动神经传导。神经生长因子（NGF）是一种神经营养因子和神经肽，主要参与调节特定目标神经元的生长、维持、增殖和存活。Moattari等人报告说，NGF预处理的MSCs在大鼠坐骨神经损伤后2周和8周增加了坐骨神经功能指数（SFI），并缩短了热水爪浸入测试的时间。用NGF-MSCs治疗显示出更好的电生理恢复，增加了幅度并减少了潜伏期。组织学评估还表明，在NGF-MSC组中，神经纤维、血管的数量和血管面积的百分比有更显著的增加。基本的人类成脂因子成纤维细胞生长因子1（FGF-1），它参与组织生长，通过提供额外的细胞生存信号来保护细胞免受压力。FGF1-MSC治疗在大鼠CCI神经病理性疼痛模型中调节了凋亡和神经炎症。在CCI模型的PNI后，凋亡蛋白和炎症标志物增加，并在MSCs和FGF1-MSCs给药后得到缓解。FGF1-MSCs的效果显著高于MSCs。3.3.4.电磁场预处理低频脉冲电磁场（PEMF）预处理促进了MSCs在坐骨神经损伤后神经再生的治疗效率。体外实验中，低频PEMF促进了BMSCs的增殖和神经元分化。与未经预处理的BMSCs相比，低频PEMF修饰的BMSCs增殖更快，并表达了更高水平的生长因子mRNA。注射低频PEMF预处理的BMSCs增加了三叉神经节中髓鞘轴突的数量、轴突密度和存活神经元的数量，从而加速了神经再生。3.3.5.针对周围神经损伤引起的脊髓损伤PNI引起的病理症状，如感觉异常/过敏、对周围神经刺激的异常反应和脊髓回路，与脊髓和DRG中的分子和形态变化有关，包括细胞凋亡、神经退行性和小胶质细胞激活。到目前为止，大多数干细胞治疗研究集中在受损周围神经的功能恢复上，忽视了PNI引起的脊髓病理变化，特别是小胶质细胞的激活和招募以及与凋亡相关的神经元死亡，这可能是临床患者在PNI后即使在治疗干预后仍遭受慢性病理性疼痛的原因之一。鉴于脊髓、DRG和周围神经在解剖上彼此接近，以及周围和中枢神经系统在功能上相连，针对PNI引起的脊髓损伤的治疗策略可能会增强干细胞治疗在PNI中的使用。在手术后第4天和第5天将1 10^6 BMSCs鞘内注入脊髓，抑制了背角神经元的退行性变，增强了神经再生，并缓解了坐骨神经损伤后的病理性疼痛。针对PNI引起的脊髓病理变化的周围给药2 10^6 NCSCs取得了有利的结果，缓解了神经病理性疼痛并增强了运动性能。
4.结论和未来展望由于其再生能力，干细胞治疗已成为增强神经疾病功能恢复的有希望的替代治疗方法。本章总结的临床前研究支持了干细胞治疗在全球脑缺血引起的CA和PNI后神经退行性变中的治疗潜力。许多类型的干细胞可以用于干细胞治疗，包括多能干细胞、NSCs、MSCs、脐带血干细胞和其他细胞类型。不同类型干细胞的安全性、可靠性、最大效率和可能的副作用，如肿瘤形成，需要进一步调查。最佳剂量、给药时间、干细胞输送方法以及细胞预处理和预条件以提高干细胞治疗的效率需要进一步研究。对于PNI，局部注射干细胞的一个潜在担忧是程序的侵入性质，这可能会降低临床转化。一项临床研究将干细胞局部注射到临床患者中。治疗效果没有报告炎症、感染或出血。除了关注PNI引起的脊髓损伤外，其他可能产生类似治疗效果的周围给药途径或其他输送策略，需要在未来的研究中验证。衰老是干细胞治疗的另一个重要问题。为了最小化由衰老引起的功能损失，至关重要的是要阐明如何快速准确地检测干细胞的衰老比例和程度。通过解决这些问题，干细胞治疗最终可能成为神经疾病的临床可行和有效治疗方法，并在未来提高患者的生活质量。
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