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原核蛋白表达小贴士2 — 表达载体，你选对了吗？
在生命科学的探索之路上，原核蛋白表达重要的技术手段。然而，在这个过程中，科研人员常常面临诸多难点。比如，蛋白表达量低得让人沮丧，好不容易进行实验，却发现经过漫长的等待后只得到微量的产物；或者蛋白错误折叠，形成难以处理的包涵体，使得后续的纯化和研究工作举步维艰；又或者在选择宿主菌和表达载体时感到迷茫，如同在迷雾中摸索，不知哪一个组合才是最佳选择。那么，如何破解这些难题呢？关键就在于正确选择原核蛋白表达的宿主菌和表达载体。你选对了吗？让我们一同深入探讨，寻找开启成功原核蛋白表达之门的钥匙。
原核表达常用载体
pET 系列载体：
优点：
高表达水平：是应用非常广泛的一类原核表达载体，具有高拷贝数，能使目的基因在大肠杆菌中实现高水平表达，适合需要大量蛋白的实验。
调控精确：利用 T7 启动子系统，T7 RNA 聚合酶具有很强的转录活性，并且可以通过加入诱导剂（如 IPTG）来精确调控基因的表达，可调节基础表达水平以优化目标基因的表达。
多种选择：有多种载体–宿主菌组合可供选择，并且有不同的融合标签和表达系统配置，还包含可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌，能满足不同的实验需求。
克隆方便：许多载体以 LIC（连接非依赖的克隆）载体试剂盒提供，可用于迅速定向克隆 PCR 产物，操作相对简便。
缺点：
基础表达：在某些情况下可能会出现基础表达水平较高的现象，对于一些对蛋白表达量和时间要求非常严格的实验，需要更精确地控制表达条件。
复杂操作：部分载体的构建和操作相对复杂，需要对载体的特性和实验操作有较好的理解和掌握。
pGEX 系列载体：
优点：
易于纯化：利用 tac 启动子，表达时会表达出包含谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标签的融合蛋白。GST 标签可以与谷胱甘肽树脂特异性结合，便于使用亲和层析进行纯化，然后再用凝血蛋白酶或者 factor Xa 因子切割融合蛋白去除标签。
提高溶解性：GST 标签有助于增加外源蛋白的溶解度，对于一些难溶性蛋白的表达有一定帮助，能够提高蛋白的稳定性和可操作性。
严谨调控：该系列载体上有一个 lacIq 基因，能够表达更多的阻遏蛋白以实现严谨的诱导调控，降低本底表达。
缺点：
标签影响：GST 标签相对较大，可能会对目的蛋白的结构和功能产生一定影响，在某些对蛋白纯度要求极高的实验中，去除标签的步骤可能会增加操作复杂性和时间成本2。
pBAD 和 pAraB 系列载体2：
优点：
诱导表达：这些载体使用 araB 操纵子，可以用来在缺乏丙氨酸解氨酶的大肠杆菌突变株中，通过 L - 丙氨酸诱导目的基因的表达，诱导条件相对温和，对细胞的毒性较小。
可调控性：可以根据加入的 L - 丙氨酸的浓度来调节基因的表达水平，实现一定程度的表达调控。
缺点：
表达水平：总体来说，其表达水平可能不如一些强启动子的表达载体高，对于需要高产量蛋白的实验可能不太适用。
宿主限制：需要特定的大肠杆菌突变株作为宿主，宿主的选择范围相对较窄。
pUC 系列载体：
优点：
高拷贝数：含有 pMB1 复制子，具有较高的拷贝数，平均每个细胞可达 500 - 700 个拷贝，有利于获取大量的质粒。
筛选方便：具有来自大肠杆菌 lac 操纵子的 lacZ’基因，所编码的 α- 肽链可参与 α- 互补作用，在 IPTG 诱导和底物 X-gal 存在下，可形成蓝色和白色菌落，便于筛选重组体。
多克隆位点：具有多克隆位点区段（MCS），便于具有不同粘性末端的外源基因的插入，克隆操作相对简单。
缺点：
表达量较低：主要是克隆载体，表达元件相对较少，表达水平相对其他专门的表达载体可能较低，一般更适合用于克隆和初步的基因操作5。
pBV220 系列载体：
优点：
温度调控：含有 clts857 基因（cl 基因的温度敏感突变体），该基因表达的 Cl 蛋白能够抑制启动子 Pr 和 Pl，又对温度敏感。所以该系列载体可以用温度对外源基因的转录进行调控，无需添加诱导剂，减少了诱导剂对细胞的潜在影响。
非融合表达：SD 序列后面紧跟着就是多克隆位点，便于带有起始密码子 ATG 的外源基因的插入并表达成非融合蛋白，有利于保持目的蛋白的天然结构和功能。
缺点：
热休克影响：在温度激活的过程中，大肠杆菌中的热休克蛋白也会表达，可能会降解表达的外源蛋白，影响目的蛋白的产量和质量。
调控不精确：温度调控相对不如诱导剂调控精确，且对实验环境的温度控制要求较高，需要精确的温度控制设备来保证实验的重复性。
pT7 系列载体：
优点：
强启动子：以 T7 启动子为核心，T7 启动子具有非常高的转录效率，能够驱动目的基因的高效表达，对于一些需要大量表达目的蛋白的实验非常有利。
专一性强：T7 RNA 聚合酶只识别 T7 启动子，具有很高的专一性，能够避免其他杂蛋白的产生，提高目的蛋白的纯度。
缺点：
宿主要求高：需要宿主细胞中含有 T7 RNA 聚合酶或者携带能够表达 T7 RNA 聚合酶的基因，如大肠杆菌 BL21（DE3）等特定的菌株，对宿主细胞的要求较高。
毒性问题：在某些情况下，T7 启动子的高表达能力可能会对宿主细胞产生一定的毒性，影响细胞的生长和存活，需要优化表达条件来降低毒性影响。
表达载体选择的考虑因素
目的蛋白的特性：
蛋白大小：如果目的蛋白相对较小，可以选择一般的高拷贝数载体，如 pUC 系列等；如果蛋白较大，可能需要选择具有较强启动子和翻译效率的载体，以确保蛋白能够顺利表达。对于特别大的蛋白，还需考虑载体的承载能力和对蛋白表达的影响。
蛋白的疏水性：疏水性强的蛋白在表达过程中容易聚集形成包涵体，此时可选择能促进蛋白可溶性表达的载体，如 pGEX 系列等。GST 标签可以增加蛋白的溶解性，有助于提高疏水性蛋白的表达水平和可溶性。
是否含有特殊结构：例如含有较多二硫键的蛋白，在原核表达系统中正确形成二硫键可能存在困难。对于这类蛋白，需要选择能够提供合适氧化还原环境的宿主菌以及相应的表达载体，或者采用特殊的表达策略，如在较低温度下进行诱导表达，以促进二硫键的正确形成。如果目的蛋白是膜蛋白，其表达和折叠需要特定的膜环境，选择的载体和宿主菌应能够在一定程度上模拟膜环境，或者选择具有相关辅助蛋白的表达系统。
表达水平的需求：
强启动子与高拷贝数：如果需要获得高表达水平的蛋白，应选择具有强启动子的载体，如 pET 系列载体中的 T7 启动子，能够使目的基因在大肠杆菌中实现高水平的表达。同时，高拷贝数的载体也有助于提高蛋白的表达量，但也要注意过高的拷贝数可能会对宿主细胞造成负担12。
诱导条件的适配性：一些载体的启动子需要特定的诱导剂和诱导条件才能实现高效表达。例如，pTrc 系列载体的 Trc 启动子可以通过色氨酸的浓度来调控目的基因的表达；pBAD 和 pAraB 系列载体利用阿拉伯糖操纵子，通过 L - 丙氨酸诱导目的基因的表达。根据实验的便利性和对表达水平的精确调控需求，选择合适的诱导系统1。
蛋白的纯化需求：
纯化标签的选择：常见的纯化标签有 His-tag（组氨酸标签）、GST-tag（谷胱甘肽 S - 转移酶标签）、Flag-tag 等。His-tag 相对较小，对蛋白的结构和功能影响较小，并且可以通过镍柱亲和层析进行快速纯化；GST-tag 较大，能提高蛋白的溶解性，但纯化后可能需要去除标签，且纯化过程相对复杂一些。如果后续实验对蛋白的纯度要求较高，需要选择与纯化方法相适配的标签和载体。
多标签系统：有些情况下，为了便于蛋白的纯化、检测或其他操作，可以选择带有多个标签的载体。例如，同时带有 His-tag 和 Flag-tag 的载体，可以利用不同的纯化方法进行验证和纯化，提高蛋白的纯度和可靠性。
宿主菌的特性：
宿主菌的兼容性：不同的原核表达载体适用于不同的宿主菌。例如，pET 系列载体通常与大肠杆菌 BL21 (DE3) 等具有 T7 RNA 聚合酶系统的菌株配合使用，能够实现高效表达；而一些特殊的宿主菌，如 Rosetta (DE3)，对稀有密码子有较好的适应性，适合表达含有稀有密码子的外源基因。在选择载体时，要确保其与所使用的宿主菌相兼容。
宿主菌的生长特性和培养条件：宿主菌的生长速度、培养温度、营养需求等因素也会影响表达载体的选择。例如，有些宿主菌在高温下生长良好，对于需要在较高温度下表达的蛋白，可以选择适合该温度条件的宿主菌和载体；而对于一些对温度敏感的蛋白，则需要选择在较低温度下生长的宿主菌，以避免蛋白的变性和降解。
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