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第三代CAR设计的重要考量：Location, Location, Location
来源：IMMUNO随笔
共刺激信号域的选择，组合，拼装对CAR-T细胞的功能，表型以及持久性都会产生不同的影响，最近一篇发表在Science Advances杂志上的标题为“Dissecting the role of CAR signaling architectures on T cell activation and persistence using pooled screens and single- cell sequencing” 的文章利用建库筛选与单细胞测序技术对CAR信号模块的搭建做了很细致的研究。
实验设计流程
CAR信号结构域组合库的构建：研究者设计了一个包含32种不同CAR变体的组合库，这些CAR变体基于第一代、第二代和第三代CAR设计，结合了CD28、4-1BB、CD40、CTLA4和IL15RA等五种不同的共刺激信号域，所有CAR变体均使用针对人表皮生长因子受体2（HER2）的单链可变片段（scFv）作为抗原结合域。
CRISPR-Cas9基因编辑：通过CRISPR-Cas9技术将CAR基因整合到T细胞的TCRα链（TRAC）基因座中，确保所有CAR变体在相同的转录调控下表达，并同时敲除TCR，以便在混合样本中比较不同CAR变体的功能。
体外重复抗原刺激（RAS）实验：模拟慢性抗原刺激，将CAR T细胞与HER2阳性的SKBR3肿瘤细胞共培养，每3天重新刺激一次，观察T细胞的效应潜力和持久性。
单细胞CAR测序（scCARseq）：在RAS实验的不同时间点（第0天、第6天和第12天），对CAR T细胞进行单细胞测序，以解析CAR诱导的T细胞表型，并通过scCARseq确定每个细胞的CAR变体。
实验结果
CAR T细胞表型的动态变化：通过单细胞测序，研究者观察到T细胞从记忆状态到激活状态，再到效应状态的动态变化，并在晚期表现出功能障碍和终末分化状态。CD8 T细胞在RAS过程中比CD4 T细胞更快地失去效应潜力，且CD8细胞数量逐渐减少，而CD4 T细胞比例增加。
CAR变体的持久性评估：在RAS实验中，CD40信号域在膜近端位置（位置A）的CAR变体显示出最高的持久性，而CTLA4和4-1BB也在一定程度上促进了T细胞的持久性。
CAR变体的早期激活特性：在与肿瘤细胞共培养6小时后，CD40在位置A的CAR变体能够快速诱导强烈的效应表型，而4-1BB则倾向于诱导效应记忆表型。
在这项研究中，五种共刺激信号域（CD28、4-1BB、CD40、CTLA4和IL15RA）在CAR结构中的不同位置（膜近端位置A和膜远端位置B）对T细胞功能的影响被系统地分析。以下是每种共刺激信号域在不同位置的表现总结：
CD28膜近端（位置A）：CD28在膜近端时能够有效激活T细胞，表现出较强的早期效应功能。然而，CD28在膜近端的CAR变体在长期刺激下表现出较低的持久性，T细胞更容易进入耗竭状态。CD28膜远端（位置B）：在膜远端时，CD28的激活能力相对较弱，对T细胞的长期效应功能影响有限。
4-1BB膜近端（位置A）：4-1BB在膜近端时能够显著增强T细胞的效应记忆表型，促进T细胞在长期刺激下的存活。4-1BB膜远端（位置B）：在膜远端时，4-1BB对T细胞的效应功能和持久性影响较小。
CD40膜近端（位置A）：CD40在膜近端时表现出最强的激活和持久性增强能力。它能够快速诱导T细胞进入效应状态，并在长期刺激下维持较高的细胞毒性功能。CD40膜远端（位置B）：CD40在膜远端时仍能促进T细胞的效应功能，但对持久性的影响不如膜近端显著。
CTLA4膜近端（位置A）：CTLA4在膜近端时对T细胞的激活和效应功能影响有限，甚至可能表现出一定的抑制作用。CTLA4膜远端（位置B）：CTLA4在膜远端时表现出较强的细胞毒性效应，尤其是在CD8 T细胞中。这可能与其内化基序有关，促进受体循环和效应功能的维持。
IL15RA膜近端（位置A）：IL15RA在膜近端时对T细胞的激活和效应功能影响有限。IL15RA膜远端（位置B）：IL15RA在膜远端时对T细胞的激活和效应功能影响有限，可能更多地起到分子间隔的作用。
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