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生物实验十一：免疫共沉淀实验（上）
本文来源于微信公众号：文献研读与分享 作者：Jansir
1. 实验原理：利用抗体捕获目标蛋白（蛋白A），并沉淀与蛋白A相互作用的蛋白（蛋白B），从而验证两者是否在天然生理条件下具有相互作用。（例如：若用蛋白A的抗体免疫共沉淀蛋白A，那么与蛋白A相结合的蛋白B也会一同被沉淀下来。即通过偶联有蛋白A的磁珠固定蛋白A的抗体，再与蛋白样品共孵育，利用抗原抗体相互作用捕获蛋白样本中的蛋白A，进而将与蛋白A结合的蛋白B一起分离出来。）
2. 实验目的：研究已知蛋白与已知或未知蛋白之间的相互作用。
3. 检测蛋白类型：
内源性蛋白：是细胞或组织中天然表达的蛋白，未经人工引入。反映生理条件下的蛋白相互作用（如天然复合物或信号通路）。操作时，直接使用野生型的细胞或组织进行CO-IP实验，无需额外处理。
非内源性蛋白：通常指外源转染或重组表达的蛋白（如带标签的过表达蛋白、突变体、荧光融合蛋白等）。如：通过转染A质粒，检测外来的A蛋白与细胞株本身存在的B蛋白的相互结合；又如：同时转染A质粒和B质粒，检测外来的A蛋白与B蛋白的相互结合，该方法较为常用，可辅助证明蛋白互作。一般选用工具细胞（如HEK293T细胞等）进行检测，且所转染的质粒带有标签，通过拉目的蛋白所带的标签蛋白来辅助证明互作。
4. 相关试剂准备：
4.1. Protein A/G磁珠或琼脂糖珠：商品化获取；
4.2. 1× Lysis/Wash Buffer（配制步骤：在800 mL 去离子水中溶解 Tris-HCl 和 NaCl，调节 pH 至 7.4；加入 NP-40/Triton X-100（及脱氧胆酸钠/SDS，如需要）；
定容至 1 L，过滤灭菌或低温保存；使用前加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂）
5. 常用名词解释
免疫沉淀（IP）是利用偶联在磁珠或琼脂糖珠上的特异性抗体，从裂解液中捕获靶蛋白及其相互作用蛋白的过程。
免疫印迹（Immunoblotting, IB）是Western blot（WB）的另一种表述，指将IP富集到的蛋白质通过电泳分离、转膜后，用特异性抗体检测靶蛋白或互作蛋白的技术（注：IB与WB常混用，但严格来说，WB是泛指技术，而IB更强调抗体检测步骤）。
Input是细胞或组织裂解后未经免疫沉淀（IP）处理的原始裂解液样本，包含裂解液中的所有蛋白质。（主要作用：验证裂解效率及样本质量；确认目标蛋白在样本中的表达水平；作为后续IP实验的参照）。
IgG阴性对照是指使用与IP抗体同种属的非特异性IgG（如小鼠IgG用于小鼠源IP抗体）偶联磁珠进行平行实验，用于排除磁珠或抗体非特异性结合造成的假阳性（注：理想情况下，IgG组应无目标蛋白信号）。
6. 具体实验步骤（如下图）：
步骤一：细胞铺板（10 cm大细胞培养皿），次日进行转染、或给药处理等常规操作；
步骤二：收集细胞，吸弃培养基，用冰预冷的1 x PBS洗涤细胞一次。去除PBS后并加入0.5 mL细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），并在冰上孵育20 min，然后刮下细胞，在4°C，12000 rpm 条件下，离心10 min，收集上清，即为细胞裂解液（最好先取一小部分裂解液进行WB实验检测并确定细胞裂解物里存在目标蛋白）；
步骤三：免疫沉淀
a) 磁珠漂洗：将商品化购买的Protein A/G Beads 充分混匀，取 20 μL加入 1.5 mL离心管中；向磁珠中加入 适量1×Lysis/Wash Buffer，轻微涡旋混匀；将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清；
b) 方法一：先制备磁珠-抗体复合物——向上述准备好的磁珠中加入抗体，抗体推荐用量5 μg，用 1×Lysis/Wash Buffer 补充体积至 500 μL，4°C条件下混旋孵育 4-20 h，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。b-2) 在离心管中。方法二：先制备抗原抗体复合物——将500 μL 细胞裂解样品(步骤二） 与抗体（5 μg）混合孵育 30 min；将孵育后的样品加入准备好的磁珠(步骤 三-a)中，4°C条件下混旋孵育 4-20 h；将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测；
c) 磁珠漂洗：向离心管中加入500 μL 1×Lysis/Wash Buffer，颠倒离心管数次或轻做涡旋混匀 1min，将离心管置于磁分离吸附后，12000 rpm 离心1 min，保留沉淀；重复第4步，共计清洗3次；
d) 蛋白复合物洗脱：方法一：向离心管中加入50 μL 洗脱缓冲液，室温混旋孵育20 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清为洗脱液，加入10 μL 中和缓冲液，按4:1比例加入5*SDS样品缓冲液，涡旋振荡，将样品加热至变性5 min，在12000 rpm下瞬时离心1 min，取上清液；方法二：向离心管中加入40 μL 1*SDS 样品缓冲液，将样品置于金属浴中，100°C金属浴中加热10 min。通过磁分离器分离磁珠，保留含有目的抗原的上样缓冲液；
步骤四：Western Blot实验检测：取适量体积样品（10 μL）上样到SDS-PAGE 凝胶上，常规Western blot实验，最后得到目的条带（如上图所示）。
（本篇主要讲述Co-IP实验检测内源性蛋白的相互作用，下期将讲述Co-IP实验检测非内源性蛋白的相互作用及数据解读，敬请关注。）
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