文章来源公众号：Biotecr视界 作者：慕羽
传统嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤治疗中成绩斐然，但体外制备复杂、成本高昂、T 细胞功能受损、难以多次给药及对实体瘤疗效有限等问题，一直制约其广泛应用。如今，体内 CAR-T 疗法横空出世，为解决这些难题带来新希望！自体、异体和体内嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法的生产回输流程体内 CAR-T 疗法通过递送系统将 CAR 基因组件直接递送至宿主 T 细胞，实现原位重编程，无需体外操作。在治疗时效性上，能快速起效，大幅缩短治疗周期；经济可行性方面，简化流程降低成本，提升治疗效率；治疗持续性上，可重复给药应对单次治疗后的疗效衰减或复发；更重要的是，利用内源性健康 T 细胞，避免体外扩增导致的细胞耗竭，为提升治疗安全性和有效性开辟新路径。自诞生以来，CAR-T 细胞技术已历经五代关键的结构演变，每一代均针对前序版本的局限进行优化，逐步提升细胞活化、增殖、抗凋亡能力及治疗安全性，尤其在实体瘤治疗领域持续突破，具体演进路径如下：第一代 CAR-T 细胞是技术的基础框架，其结构由三部分核心组件构成：负责识别肿瘤抗原的抗原结合域（单链可变区片段，scFv）、连接细胞膜内外的跨膜域，以及启动 T 细胞基础活化信号的CD3ζ 信号域。然而，仅依赖 CD3ζ 单一信号的激活模式存在明显缺陷 ——T 细胞的细胞因子分泌量不足，体外及体内增殖能力较弱，最终导致治疗效果受限，难以满足临床需求。为解决第一代的功能短板，第二代 CAR-T 细胞引入关键改进：在原有结构基础上整合共刺激分子（CD28 或 4-1BB）。这一优化产生了多重协同效应：不仅显著增强 T 细胞的活化效率与增殖速率，提升细胞因子分泌水平，还能增强 T 细胞的抗凋亡能力、延长其在体内的存活时间。在临床应用中，第二代 CAR-T 细胞展现出突出优势，尤其在血液肿瘤（如 B 细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤）治疗中疗效最为显著，成为当前血液肿瘤 CAR-T 治疗的主流技术方向。第三代 CAR-T 细胞试图进一步强化共刺激信号，采用 “双共刺激分子串联” 设计，例如将 CD28 与 4-1BB 两种共刺激分子同时整合到 CAR 结构中。理论上，双重信号可能进一步提升 T 细胞功能，但实际临床应用中，其治疗效果与第二代相比未体现出明显优势，临床优势不突出，因此未实现大规模推广。第四代 CAR-T 细胞则转向 “功能拓展与安全调控”，在第二代结构基础上新增两类核心模块：一是细胞因子分泌模块（如IL-12），可通过调节肿瘤微环境、增强免疫应答来改善治疗效果；二是安全开关（如诱导型CASP9），能在出现严重不良反应时快速清除 CAR-T 细胞，降低治疗风险。这一改进使 CAR-T 细胞在保持疗效的同时提升安全性，尤其在实体瘤治疗中展现出突破性潜力，为攻克实体瘤的免疫抑制微环境提供了新策略。第五代 CAR-T 细胞聚焦 “T 细胞功能优化与毒性控制”，同样以第二代结构为基础，创新整合细胞因子受体信号域（如IL-2Rβ）。该信号域可激活 JAK-STAT 信号通路，从分子层面显著增强 T 细胞的活性、体外增殖能力与体内持久性，同时优化 CAR-T 细胞的整体功能特性。更重要的是，其独特的细胞因子调控机制能减少过量细胞因子释放，从而降低细胞因子释放综合征（CRS）的发生风险。在体内递送 CAR 时，需满足精准靶向 T 细胞、高效基因编辑能力及低毒性等严格标准。目前，病毒载体、非病毒载体与可植入生物支架是 CAR 递送系统中已被广泛研究和应用的三大核心类型。作为无包膜小型病毒载体，其遗传物质为约 4.7kb 的环状 DNA，治疗基因可在细胞核内以附加体形式稳定表达。它免疫原性低，能高效穿透肝脏、肌肉、大脑等多个器官，但存在载体容量有限、基因有极小概率整合到人类 DNA 引发肿瘤风险，且约半数人群血液中存在中和抗体限制其效用。当前通过利用不同 AAV 亚型的器官靶向能力、采用组织特异性启动子来优化，同时需长期监测大剂量 AAV 在人体中的肝脏安全性。可突破细胞状态限制，感染分裂或静息期细胞，能将治疗基因永久整合到细胞 DNA 实现长期表达。其 8kb 的大容量足以装载复杂 CAR 结构，且天然靶向 T 细胞，但存在基因整合意外破坏关键基因致癌、生产依赖复杂多质粒组装系统导致成本高，以及部分病毒蛋白可能引发免疫反应或细胞因子风暴等问题。现有自灭活载体、CRISPR-Cas9 引导靶向整合到安全基因组位点、整合缺陷型载体等策略降低风险，同时需通过高通量测序监测整合位点并建立长期随访机制。仅感染活跃分裂细胞，可通过逆转录酶将 RNA 基因组转录为 DNA 并整合到宿主细胞基因组，实现外源基因长期稳定表达。但强随机整合特性易破坏关键基因（如 2003 年 X-SCID 治疗中引发 T 细胞白血病），且免疫反应强、生产效率低，目前主要用于体外 CAR-T 细胞制备，体内递送需严格设计安全开关并开展详细风险评估。通过衣壳蛋白工程重塑病毒外壳增强器官靶向能力、启动子优化实现精准基因调控、添加聚乙二醇 “隐形涂层” 避免免疫清除等基因改造，大幅提升递送性能，但长期生物安全性及大规模生产可扩展性仍需进一步验证。通过带正电脂质分子自动包裹核酸形成稳定纳米复合物，可高效递送多种治疗分子。能将难溶性药物吸收率提升 3-5 倍，双层结构抵御光照、氧气及酶降解，4℃下可稳定半年以上，表面修饰 CD3 抗体等可实现精准细胞递送，还支持同时包裹多种分子用于联合治疗。不过载药量低，对储存条件敏感，部分阳离子脂质可能引发轻度炎症，生产依赖精密微流控技术，新型可电离脂质工艺已推动其性能突破。通过静电吸附携带基因药物，表面修饰定位装置后特定细胞摄取率超 80%，聚合物外壳可保护基因免受核酸酶降解，且能通过调节聚合物分子量与单体组成控制药物释放速率。但约 30% 载体因稳定性过高无法完全释药，20% 因过早降解泄漏药物，生产需复杂工艺控制粒径与载药量导致成本高，聚乙烯亚胺等材料可能引发剂量依赖性细胞毒性且储存易聚集，未来需引入 pH 敏感键、优化冻干工艺及利用机器学习设计聚合物结构。人体自身分泌的载体，天然生物相容性好，表面 CD47 “别吃我” 信号延长体内存活时间，可通过膜蛋白导向特定器官并穿透血脑屏障。但生产效率低、载药效率差、稳定性不足，且不同来源外泌体风险各异（如 CAR-T 细胞来源外泌体有抗原偏移引发免疫攻击风险），临床转化需解决长期基因组整合风险、免疫原性变化等安全问题，同时推动生产标准化与体内精准追踪技术发展。通过优化表面涂层技术，可将降解时间控制在数周至数月。能局部原位生成 CAR-T 细胞降低全身毒性，但需手术植入增加感染风险且延长患者恢复周期，支架材料可能引发免疫排斥形成瘢痕组织损害 CAR-T 细胞功能，物理尺寸与材料特性也限制载药能力。小鼠模型中 MASTER 支架生成释放的 CAR-T 细胞持久性与抗肿瘤效果优于传统疗法，目前需更多临床试验验证其长期安全性及潜在免疫反应。载体选择对 CAR-T 治疗成功至关重要，各类载体优势与挑战鲜明：病毒载体中，LV 因大容量与天然 T 细胞靶向性成体外制备主流，AAV 受限于容量、预存抗体及肝毒性，RV 基本退出体内递送。非病毒载体中，LNPs 引领体内 mRNA 递送创新，聚合物载体面临释药与毒性问题，外泌体受困于生产与载药效率；生物支架需突破手术、排斥及载药限制。临床转化中，不同载体应用场景差异显著，需针对性优化以推进 CAR-T 治疗发展。
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