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hiPSCs的单细胞克隆的标准化流程——可生长、高效，同时确保多能性

2022-06-24

人类诱导多能干细胞（hiPSC）越来越多地应用在药物发现、合成生物学和细胞治疗工作中。然而，将hiPSC分离成单个细胞进行培养仍然是一个重大的生物学和技术障碍。目前的技术仍依赖于低效的方法，如有限稀释法（LD）、克隆挑选和荧光激活细胞分选（FACS），这些方法耗时、昂贵，并且灵敏度不高。此外，这些方法提供的单克隆性证据不足。

Advanced Instruments （安达望）之前已经确定了在创建主细胞库（MCB）时，单细胞接种平台VIPS™ 的优势（见图1）位于手动有限稀释法之上，这有助于形成治疗性CHO和HEK细胞株克隆性的行业标准。最近，随着层粘连蛋白基质MatriClone™ 的出现, VIPS现在能够在保持高活力的同时进行高效干细胞接种。重要的是，VIPS能够在无堵塞的情况下正常接种高浓度培养基/基质细胞液滴，并且能够在每个96孔板上持续提供30个或更多个单细胞来源的克隆团。

图1

本应用描述了如何使用VIPS仪器及优化的培养条件，以稳健和自动化的方式成功地对几个不同的hiPSC细胞株进行亚克隆。这种方法已被证明可以减少时间和成本，同时最重要的是保持细胞表型和基因组完整性，从而使hiPSC的可行、高效单细胞克隆过程标准化，同时确保表型的一致性，并提供细胞株单克隆性的记录证明。

结果

提高的活细胞克隆的生长性

与有限稀释法（图3）相比，VIPS能够证明高接种效率（图2），每个平板上单细胞来源的克隆团的数量显著增加。

图2。溶液中使用MatriClone，标准有限稀释法（LD）和VIPS铺板比较每个平板的hiPSC克隆团数。

图3。在溶液中使用MatriClone对hiPSC进行高效VIPS单细胞接种（绿色孔代表成功分离到单个细胞）。

表型、遗传稳定性和分化能力的维持

通过亚克隆实验，我们能够证明以下各项：

在第10天保持VIPS接种克隆的多能性（图4）

图4。VIPS接种hiPSC克隆在生长10天后维持Oct4表达。

通过核型分析维持遗传稳定性（图5）

图5。通过G显带确定的健康核型证实了遗传稳定性。

扩增克隆的持续多能性（图6）

图6。通过免疫细胞化学扩增的hiPSC克隆维持Nanog和Tra-1-60的多能性标记表达。

维持分化能力，说明多能性（图7）

图7。分化为混合皮质神经元证实了功能性。

结论

总之，本应用描述了一个简单而稳健的工作流程，用于使用VIPS和MatriClone的平台技术组合进行hiPSC的单细胞克隆。MatriClone是一种基于层粘连蛋白的无动物成分基质，使用在驯化步骤的溶液中，在接种的细胞池中以及接种后的培养基中，无需预涂板或使用来源不明的基质。

VIPS仪器具有双重功能的高效单细胞接种工具，既可以具有液滴内细胞检测又有全孔成像，以提供克隆性保证的“双锁”。与传统的劳动密集型单细胞克隆方法（如LD）相比，这种组合具有显著的优势，每个平板上确认的单细胞克隆团数量更多。VIPS还可以进行每日全孔成像，以记录和追踪克隆生长。此外，VIPS还会生成克隆性报告，描述克隆从液滴中的细胞到完全形成的克隆的全过程。该报告可作为向法规部门IND申请文件的一部分，用于客户开发细胞疗法。

该强有力的工作流程有可能直接影响细胞治疗和发现研发中克隆性的标准、一致性和信心。此外，该工作流程已经对细胞治疗公司产生了影响。

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