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建立基因编辑的iPSC克隆细胞库
根据我们的经验，对于简单的敲除，需要产生100-150个克隆，才能产生10个适合建库的克隆。对于基因编辑中的多个敲除，可能要求超过1000个克隆，才能产生10个适合建库的克隆。在这种规模下，有限稀释法不是一个切实可行的选择。 VIPS是一种自动单细胞接种设备，可在非常低的压力下将单个细胞分配到96或384孔板中。VIPS将纳升体积的细胞液滴到微孔，然后z轴叠层拍20张照片来验证孔内是否存在单个细胞，然后应用人工智能来识别是否存在单个细胞、无细胞或多个细胞。VIPS随后会自动向孔中填充培养基，然后整孔成像以支持单个细胞的存在。这种双重时间点的单克隆性图像（双锁验证）是未来向监管部门提供证据的关键组成部分。 我们使用核糖核蛋白（RNP）传递的CRISPR-Cas9技术敲除hiPSC系中的EMX1基因（编码神经元模型形成的转录因子）位点。将核糖体蛋白转染入核后，通过VIPS或有限稀释法（LD）作为对照将hiPSC作为单细胞接种到96孔板中，然后在含有MatriClone的培养基中扩增。在VIPS系统上每天对96孔板进行全孔成像，以确认克隆起源，并跟踪克隆的生长。 VIPS与LD相比，在每个平板上成功获得单克隆的数量提高了3-4倍。在这项研究中，仅仅三块VIPS接种的96孔板就产生了100个单克隆，然后进行选择和基因分型，以确认EMX1基因座中indel（碱基插入或缺失）的形成。两个已确认indel的克隆随后被扩增并进行表征。 结果 图1。单细胞播种和克隆生长来自gRNA#2种子池。图像来自VIPS软件。 图2。VIPS群体形态评估，利用神经网络算法检测iPSC汇合度。 图3。基因编辑的iPSC通过VIPS单细胞接种的效率和克隆生长的示例。 图4。对分配的液滴进行自动图像分析，可以从多个细胞、空孔和细胞碎片中分离单个细胞，以支持克隆性证据。 图5。扩增的hiPSC克隆中的indel形成和多能性标记物表达的表征：克隆E2是纯合缺失，两个等位基因上都有一个碱基缺失；克隆F2是一种复合纯合缺失，一个等位基因有2个碱基对缺失，另一个等位基因有10个碱基对缺失。 图6。为VIPS单细胞铺板的基因编辑的iPSC的建库提供克隆性证据而设计的自动化工作流程。 结论 致谢 长按或扫描上方二维码关注我们 Advanced Instruments成立于1955年，总部位于美国马萨诸塞州诺伍德，60 多年来一直致力于帮助生物制药，临床及食品饮料行业客户提升测试结果的质量，实现可信赖的实验结果，并不断提高企业的生产效率。 安达望（上海）科技有限公司是Advanced Instruments在中国依法成立的全资子公司。
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