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渗透压参数助力优化病毒载体生产，提高效率，节约成本
虽然体内基因疗法获得了越来越多有利的临床数据，但仍有许多挑战亟待解决。为了使更多的患者群体能够获得并负担得起这些疗法，生产能力、供应链物流、生产和纯化产量仍然是基因疗法需要重点改进的方面。改进的关键是通过实施高质量的工艺设计和工艺参数，以确保稳健性和可重复性。工艺开发是上游和下游的关键，近年来，渗透压(溶质浓度的衡量指标)已被证明与整个基因治疗工艺流程密切相关。例如，在上游载体生产中，渗透压是影响产量、质量和工艺效率的因素之一【1】。以下内容介绍了 Cell and Gene Therapy Catapult 于 2021 年 6 月研究完成的全新数据。结果表明，特定时间点调整渗透压能够显著提高 AAV 的产率和质量。此外，该研究发现通过上游的渗透压调整对胞外和胞内病毒载体产量产生深远影响，并有可能显著减少病毒载体生产的时间和成本。
材料和方法 · 工艺过程研究采用赛多利斯生物反应器 Ambr15 和 Ambr250 · HEK293 悬浮细胞，瞬时转染（AAV1,GFP） · 代谢物检测采用 Nova BioProfile® FLEX2 · 病毒基因组滴度评估采用针对 AAV2 ITRs 的 qPCR · 衣壳滴度测定采用商业 AAV1 ELISA 试剂盒 · 细胞计数采用 ChemoMetec NucleoCounter® NC200 · 渗透压测试采用安达望（Advanced Instruments）OsmoTECH PRO 多通道微量渗透压仪 OsmoTECH® PRO 多通道微量渗透压仪
结果 图1：在不同时间点添加 NaCl 和山梨醇筛选，得到的病毒滴度 转染 48 小时后，通过 NaCl 将渗透压调整到 500mOsm/Kg，特异性 AAV 滴度比对照条件下病毒滴度显著增加了 25%。在接下来的研究中，我们选择了这一条件进行更深入研究。 图2：在不同时间点添加 NaC 和山梨醇时，筛选得到的病毒载体实心率比值 当在细胞培养过程后期改变渗透压时，病毒载体产量有增加的趋势。转染 48 小时后，通过 NaCl 调节渗透压至 500mOsm/Kg，获得的病毒载体实心率（full/empty）增加。 图3：培养基渗透压调整至 500mOsm/kg 与对照组的胞外病毒基因组随时间变化情况;补料研究：在转染后 6 小时进行补料来提高 AAV 的产量 最后，我们观察到，将培养基渗透压调整至 500mOsm/kg 后，转染后 96 小时，可以最大化细胞外病毒基因组。转染后补料对上清中 AAV 的释放有不利影响。 讨论 生产病毒载体的科学家们面临着两大挑战： · 工艺产率低 · 生产成本高 以上数据揭示了如何利用渗透压参数解决第一点挑战。关于第二点挑战，图 3 所示，高比例的胞外病毒基因组显示了令人振奋的可能性：即可以在不需要破碎细胞的情况下实现可接受的产量。这将在简化下游纯化步骤方面产生深远的影响。甚至可能实现直接捕获，省去澄清步骤。但还需要进一步优化来实现这一目标，因为渗透压偏移带来的效益似乎与矩阵有关，需要研究不同的时间点和渗透压值。所有这些影响因素都将通过节省试剂、原料和洁净室时间对货物成本 (CoGs) 产生直接影响。为了评估这些变化的影响，需要在延长生产时间与尽可能多的回收上清液中的产品并简化纯化工艺之间平衡，这可以成为 CoGs 分析的对象和主题。
参考文献：
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