产品中心
技术交流
扫描二维码
我们的细胞计数仪准吗？-- 看ICON 是如何做到精准计数的！
在细胞株开发 (CLD) 中，从细胞培养方法的优化和标准化到细胞健康监测，都依赖于细胞计数和活力测定，并贯穿整个 CLD 包括单细胞分离、克隆选择、扩增和随后的震荡培养 (Thunyaporn, Doh and Lee, 2021) 。
目前自动化和半自动化细胞计数器使用阈值算法对染色后的细胞图像进行分析，从而减少误差并节省时间 (Fagète, Steimer and Girod, 2019) 。然而，这可能需要一定程度上手动校准例如仪器校准或图像检测时的的阈值设定，增加了结果的不稳定性。此外，很多细胞计数仪还存在通量不够且数据管理效率低的劣势。
ICON 的活细胞计数原理是基于人工智能的神经网络算法，计算机通过对染色细胞形态例如圆度、大小、平整度等参数的充分学习，进行计数或者活细胞与死细胞的判定。快速、准确，避免了人为因素所导致的结果偏差。此外，样品用量少 (20 μL) ，一次可以检测多达 24 个样品，仅需 4 分钟，使其成为静态和悬浮培养板的理想选择。此外，我们从 CLD 的流程及实验人员的实际需求出发将 IgG 滴度测定功能整合进 ICON，轻松实现克隆产率结果的快速获取。
本篇重点对 ICON 活细胞计数及活率测定功能进行准确性的验证，并与市面上同类知名产品进行比较，结果显示，ICON 细胞识别算法准确，重复检测样品时结果变异较低，最终提高了结果准确度，并节省了时间，使其成为高通量 CLD 工作流程的理想选择。
实验材料 我们使用 CLD 中常见的细胞类型 CHO 和 HEK 作为实验材料，并从静态及摇瓶培养阶段分别取样，以涵盖不同培养阶段的检测情景。具体材料为： • 在 CD OptiCHO (Gibco 12681029) + 8mM GlutaMAX (Gibco35050061) 中悬浮培养的 CHO-S (Gibco R800-07) • 在 Expi 表达培养基 (Gibco A1435102) 悬浮培养的Expi293F (Gibco A14527) • 在 DMEM High Glucose (Sigma D5796) + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco 10270106) 贴壁培养的293T (ECACC 12022001) • 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) (Gibco 10010023) • 0.4% Trypan Blue (Gibco 11538886) (filtered and diluted with 1x PBS to produce a 0.125% solution for ICON) • ICON 细胞计数玻片 (Advanced Instruments RS-3010)
ICON Network 验证 首先，我们对神经网络的性能进行验证，使用人工标记活/死细胞的台盼蓝染色 CHO-S、Expi293F 和 293T 细胞图像（每株 27 张，共约 23000 个）作为数据集进行训练，此外每个细胞株的另外 16 张被标记的图像（共约 16,500 个染色细胞），作为 ground truth（即通过直接观察知道是正确的）。我们通过两种评价指标即：细胞计数的准确性和细胞识别的有效性（由平均精确度的平均 mAP 给出），来评估神经网络的性能。 其中，细胞计数精度计算为活细胞和死细胞的真实情况和计算机识别之间的平均百分比差异，其中正百分比差异表示计算机识别过度，负百分比差异表示识别不足。 而 mAP 则是一种通过精度和召回率来评估目标识别算法性能的指标。在这种情况下，“精度”指的是正确识别与所有识别的比例: 而“召回率”衡量的是正确识别与 ground truth 中所可识别的比例: 将精度值与召回值绘制成精度-召回曲线。然后，计算曲线下方活/死细胞的平均值结确定 mAP。由于精度和召回值总是在 0 和 1 之间，mAP 值也会在这个范围内，其中接近1的值表示网络具有高效的细胞识别能力。 下面我来看看 ICON 的细胞识别算法的准确性。 在对三类细胞类型的识别结果中，细胞计数精度在 ±1-7%。以 CHO-S 的差异值最小即 ±1-3.5%（图1）。 图1：计算机network和ground truth细胞计数之间的平均百分比差异。
图2 展示了所检测的三类细胞株的 mAP 值，在 0.85 到 0.90 之间（图2），即 ICON 的细胞识别算法模型在细胞活率检测上非常优异。 图2: 各细胞株对活细胞及死细胞识别得平均精确度得平均值。 线性回归 (R2) 及变异系数 (CV) 精确度分析还可以使用一定稀释比例下的细胞浓度的线性回归值 (R2) 以及重复实验下的变异系数 (CV) 进行评估。 那么，R2 浓度线性回归值是通过绘制稀释倍数与细胞浓度的关系来确定的（图3）。然后对每个线性进行简单的线性回归，求的 R2 值，通过数据内的方差比例来量化模型的“拟合优度”。R2 值为 1 表示变量之间的完美线性关系，R2 值越接近 1，回归模型对数据的拟合越好。我们可以看出 ICON R2 值在 0.93 到 0.98 之间，而同类产品的 R2 值较低，在 0.81 到 0.93 之间。 图3：A) CHO-S, B) Expi293F和C) 293T 细胞株的浓度线性，其中 n=45 / 稀释倍数，±SD 变异系数 (CV) 的计算方法是用一个样品三次重复的标准差除以平均值，那么 CV 值越低，样品测量结果可重复性越好，也就是机器的精度越高。我们使用 450 个样品对 ICON 及同类产品分别进行测试，其中 CV 以百分数计，我们以 5% 及 10% 作为两个评价标准。统计发现在 %CV≤5% 的情况下，ICON 有 369 个样本，占总样本量的 82%；而同类产品的样本量是 198，占总样本量的 44%。当 %CV≤10% 的时候，ICON 增加到 93%，同类产品为 62%（图4）。从数据分析得出，ICON 在低变异系数下的样品占比高，换言之，在同样样品量的情况下，ICON 的重复变异性小，结果更准确，更节省时间。 图4：%CV 在 ≤5%及≤10% 条件下，ICON 及同类产品的样本数量占比。(n=450)
结 论 ICON 以其优秀的细胞识别算法，保证了在细胞计数及活率检测方面功能的准确性。我们发现 ICON 对各类细胞株的识别都是非常准确的，比如它在 293T 和 Expi293F 细胞株上的识别准确度 (mAP) 在 1-7% 之间，而在 CHO-S 样本分析中，准确度在 1-3.5% 之间。在整个应用验证中，ICON 的线性回归分析精度高，变异性小，3 个细胞株浓度和活力的平均 R2 值分别为 0.96 和 0.98，明显高于同类产品的平均值 0.88 和 0.89。ICON 还显示出一致和可靠的测量结果，450 个三重复中 82% 的样本量变异系数 ≤5%。这再次显著高于同类产品，后者只有 44% 的 CV 值 ≤5%。当使用 ≤10% 的精度阈值时， ICON 可以达到 93%，而同类产品只有 62%。 因此，ICON 在细胞计数及活率测定方面得准确程度是值得信赖的。另外，低样品检测量，速度快以及手动要求低，使细胞系开发工作流程简化和加速。此外，内置软件 STUDIUS 能够对数据进行追踪和高效的管理。总之，ICON 和 STUDIUS 双剑合璧克服了工作流程中的劳动时间密集瓶颈，在不牺牲精度或准确性的情况下更快地进行细胞计数，且消除人工数据评估分析处理带来的误差风险，确保理想克隆的高效筛选。
参考文献：
长按或扫描上方二维码关注我们 Advanced Instruments成立于1955年，总部位于美国马萨诸塞州诺伍德，60 多年来一直致力于帮助生物制药，临床及食品饮料行业客户提升测试结果的质量，实现可信赖的实验结果，并不断提高企业的生产效率。 安达望（上海）科技有限公司是Advanced Instruments在中国依法成立的全资子公司。
粤公网安备 44010602000473号
粤ICP备09063491号
营业执照
