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载体家小课堂 | 一文了解溶瘤病毒疗法之重组牛痘病毒
溶瘤病毒疗法是一种当前正在快速发展的新型治疗肿瘤的手段。该疗法旨在使用特殊的经过实验室改造获得的溶瘤病毒（Oncolytic Virus），使其选择性地在肿瘤细胞内复制使肿瘤细胞裂解，同时活化体内免疫反应促进溶瘤反应，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。相对于传统放、化疗和手术治疗，溶瘤病毒特异性杀伤肿瘤细胞，不损伤正常细胞，无显著的毒副作用，因此在治疗肿瘤上具有特殊的优势。
而在溶瘤病毒疗法中，牛痘病毒是常用的溶瘤病毒载体“利器”。著名学者David H. Kirn和Steve H. Thorne在《自然》杂志发表了题为Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer的文章，讲述了痘病毒（如牛痘）是最佳溶瘤药效团。
牛痘病毒
Vaccinia virus，VACV
牛痘病毒，又称痘苗病毒，属于痘病毒科（Poxvirus family），是一种线性双链DNA病毒，其野生型病毒基因组大小约为190 kbp。该种病毒在宿主细胞的胞浆中复制。病毒在复制的早期会产生一系列免疫调控蛋白，以帮助其逃避宿主的内源性的病毒防御机制。
VACV拥有一系列优点用于免疫治疗领域。作为一种大型病毒，重组VACV可以整合相当大的外源基因，基因组可达130,000-375,000 kbp。VACV具有广泛的组织嗜性，可以感染多种类型的宿主细胞。
牛痘病毒结构
具有感染性的牛痘病毒有两种形态，分别为细胞内成熟病毒（IMV）和细胞外包膜病毒（EEV）。前者需要通过裂解细胞才能释放，而后者则通过细胞分泌释放。EEV相对IMV在病毒最外层具有多一层的磷脂双分子层包膜。
尽管作为DNA病毒，VACV的基因组复制很少依赖宿主细胞。VACV可以利用自身的病毒蛋白对其DNA进行复制。
重组牛痘病毒作为溶瘤病毒
⌈ 直接裂解肿瘤细胞 ⌋
重组VACV作为溶瘤病毒具有相当的潜力。历史上，VACV长时间用于水痘疫苗的接种已证明其应用于人体具有良好的安全性。此外，重组VACV可以整合大容量的外源基因，并且具有广泛的组织嗜性。在针对肿瘤层面，VACV拥有以下几点优势：
1-VACV具有良好的裂解细胞的能力，并且其复制周期很短，只有8 h。整个病毒复制只发生在胞浆，因此没有病毒DNA整合宿主基因组的风险。
2-VACV的mRNA转录不依赖于宿主细胞的蛋白质组分，因此对宿主细胞的生物学影响较小。
3-VACV不使用特定的包膜蛋白介导其进入细胞，因此可以感染相当多的细胞类型。
4-该病毒的最外层包膜来源于宿主的细胞膜成分，有利于其逃避宿主的免疫系统反应。此外，VACV感染的细胞会分泌与C4b和C3b结合的补体控制蛋白，从而抑制经典或旁路补体激活途径，帮助病毒躲避宿主细胞补体系统的攻击。因此作为溶瘤病毒时，VACV具有很好的稳定性并且可选择以静脉滴注的方式经血流远端靶向肿瘤细胞。
5-通过删除在非肿瘤细胞中活跃的病毒基因，VACV具有特异性在肿瘤细胞中复制并使其裂解的能力。
⌈抗肿瘤免疫反应⌋
除了直接裂解肿瘤细胞，VACV还具备调节肿瘤微环境的能力，如招募细胞因子、激酶以及免疫细胞以增强抗肿瘤免疫反应。
以牛痘病毒制备的JX-594肿瘤疫苗为例，该疫苗已经在临床1/2期证明可以靶向多种肿瘤（肝癌、胃癌等），并表现出良好的安全性和溶瘤能力。JX-594经过改造可以表达人粒细胞单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因，同时通过突变胸腺嘧啶激酶（TK）基因来增强抗肿瘤免疫反应。
牛痘病毒载体克隆与病毒包装
云舟生物可采用以BAC为基础的VAC-BAC载体系统克隆VACV WR株的基因组，并整合有GFP序列以及两个loxP位点。如果需要向VACV基因组引入GOI，则采用Cre重组酶介导的DNA重组机制将GOI插入该载体。VAC-BAC载体的GOI通常放置于VACV启动子（即p7.5早期/晚期启动子）的下游，整合于TK基因的J2R位点。TK因此突变失活，从而使其选择性地在肿瘤细胞中复制而不伤害正常细胞。
VAC-BAC载体表达盒示意图
然而这样的VACV病毒的DNA自身在允许细胞中是无复制能力的。包装VACV时，实际上为恢复VACV的感染性，还需要转导一个辅助性的鸡痘病毒至包装细胞。鸡痘病毒在鸟类细胞中可复制，但是在包装用的哺乳动物细胞中无法复制。
VACV可以感染多种细胞，因此可选择不同的细胞系用于VACV包装流程，比如CV-1和BHK-21细胞均表现出良好的转染效果，而HeLa细胞适用于病毒的后续扩增。云舟生物使用噬斑纯化的方式获得单克隆的纯化重组VACV，然后采用蔗糖密度梯度离心进一步纯化病毒组分。
云舟生物验证扩增的VACV病毒的感染效果。VACV感染HeLa细胞后72小时拍摄。死去的细胞团块表明活病毒的存在。放大倍数：100×。上：明场。下：EGFP。
【参考文献】
[1] Al Yaghchi, C., Zhang, Z., Alusi, G., Lemoine, N. R., & Wang, Y. (2015). Vaccinia virus, a promising new therapeutic agent for pancreatic cancer. Immunotherapy, 7(12), 1249–1258.
[2] Ferguson, M. S., Lemoine, N. R., & Wang, Y. (2012). Systemic delivery of oncolytic viruses: Hopes and hurdles. Advances in Virology, 2012, 1–14.[3] Kirn, D. H., & Thorne, S. H. (2009). Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer. Nature reviews. Cancer, 9(1), 64–71.
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