美国奥古斯塔大学的研究人员通过人类肿瘤组织和小鼠肿瘤模型上的研究发现，肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是结直肠癌等肿瘤微环境中主要的CD73hi群体。这项成果发表在《Nature Communications》杂志上，表明结直肠癌建立了一个交互式检查点网络，以阻止免疫系统攻击。

研究背景

⭐CD73是癌症免疫治疗的新兴靶点之一。它是一种常见的免疫检查点，可将激活免疫反应的ATP转化为抑制免疫反应的腺苷（ADO），从而抑制免疫反应。以往的研究发现，肿瘤组织中的CD73水平升高与不良临床结局有关。然而，肿瘤微环境中CD73活性的主要来源仍未明确，具体机制也不清楚。

⭐CAF来源于正常的成纤维细胞，包括组织内的成纤维细胞和骨髓来源的间充质干细胞（MSC）。CD73已经被用作于MSC标记物之一，故需检测CD73在CAF上的表达，以及CAF-CD73在TME中是否有强制免疫检查点通路。

研究材料

⭐C57BL/6小鼠，CD73null (B6.129S1-Nt5etm1Lft/J)小鼠，GFP-Tg (C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J)小鼠, A2Bnull (B6.129P2-Adora2btm1Till/J)小鼠，E.G7-OVA细胞，mc-38细胞，C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞（购于赛业OriCell®，货号MUBMX-01001），人类大肠癌临床标本等。

技术路线

① 分析人结直肠癌（CRC）标本，发现CD73高表达是人类CRC-CAF的独特特征。

② 对已发表的结直肠癌转录组数据集进行主成分分析，研究人类结直肠癌肿瘤微环境中的CD73高水平表达与CAF丰度、免疫抑制增强和预后不良之间的关系。

③ 进行双向骨髓移植研究EG7肿瘤微环境中的CD73失活对肿瘤的影响。

④ 通过在缺氧环境下培养EG7-CAF和MSC，分析CAF-CD73上调的分子机制。

研究结果

⭐CAF是CD73活性的主要来源

研究人员首先分析了多份人结直肠癌（CRC）标本，以分析肿瘤相关成纤维细胞中的CD73表达。他们发现，CD73蛋白表达高度集中在成纤维细胞基质或肿瘤相关成纤维细胞上。多个数据集的比对分析表明，CD73高表达是人类CRC-CAF的独特特征。

之后，他们对已发表的结直肠癌转录组数据集进行主成分分析，发现CD73表达与CAF丰度之间存在正相关。重要的是，557名患者的NT5E（CD73编码基因）高表达与较差的临床结局相关。这些结果表明，人类结直肠癌肿瘤微环境中的CD73高水平表达与CAF丰度、免疫抑制增强和预后不良呈正相关（图1）。

图1. CD73高水平表达与CAF丰度和预后不良相关

他们接着使用了小鼠EG7 T淋巴瘤模型，发现EG7-CAF与人类CRC-CAF相似，代表了独特的CD73hi/+群体，在肿瘤微环境中形成广泛网络。接下来，研究人员又分析了CD73活性对肿瘤生长的影响。他们比较了Cd73null和WT小鼠的EG7 T淋巴瘤进展，发现Cd73null小鼠的肿瘤进展受阻，而WT小鼠则进展迅速。

为了验证CAF-CD73的贡献，他们后续开展了双向的骨髓移植，将WT或Cd73null小鼠的骨髓移植到致死剂量辐照的GFP转基因小鼠中，再将GFP转基因小鼠或Cd73null小鼠的骨髓移植到辐照的Cd73null小鼠中，并在2个月后接种EG7肿瘤。值得注意的是，接受WT或Cd73null骨髓的Cd73null小鼠经历了肿瘤完全消退（图2）。后续分析表明，Cd73null CAF无法产生腺苷，就无法抑制T细胞的活化和增殖。因此，EG7肿瘤微环境中的CD73失活可导致抗肿瘤免疫增强和随之而来的肿瘤消退。

图2. CD73失活可导致肿瘤消退

⭐CAF-CD73上调的机制分析

研究人员还还分析了不同大小的EG7肿瘤，发现肿瘤越大，CAF越多，而CD73水平也随之增加。为了阐明CAF-CD73上调的分子机制，他们首先在缺氧环境下培养EG7-CAF和MSC，发现Nt5e mRNA和细胞表面CD73的表达均未升高。随后在腺苷存在的情况下培养CAF，发现Nt5e的表达显著提高。

不同亚型的腺苷受体是组成型的，但在不同组织中差异表达。RNA-seq分析结果表明，Adora2a (A2a)和Adora2b (A2b)是成纤维细胞基质中表达的主要亚型。qRT-PCR分析则表明，T细胞主要表达A2a，而CAF和MSC优先表达A2b。他们还发现，A2B拮抗剂而不是A2A拮抗剂能阻止腺苷诱导的CD73上调。实验中使用的MSC由赛业OriCell®提供。

研究人员发现，随着肿瘤及其CAF的生长，肿瘤中会发生自然细胞死亡。高水平CD73很容易将垂死的肿瘤细胞释放的ATP转化为腺苷，而腺苷通过激活免疫细胞上表达的A2A受体来抑制免疫反应。与此同时，腺苷还激活了另一种CAF上表达的受体A2B，并促使CAF产生更多的CD73。他们认为，尽管A2A和A2B都是腺苷受体，但它们并不是冗余的，因为它们在抑制免疫反应方面的作用不同。

进一步的分析发现，在EG7荷瘤小鼠中，A2A拮抗剂ZM241385、A2B拮抗剂PSB1115和CD73中和抗体的结合使用显著抑制了肿瘤进展，导致一些小鼠中的肿瘤完全消退（图3）。这表明，阻断肿瘤微环境中A2A、A2B和CD73的非冗余功能可最大程度逆转免疫抑制。

图3. CD73中和结合A2A和A2B拮抗剂可导致肿瘤消退

总结

总的来说，这项研究揭示了CAF的一种之前未发现的免疫抑制功能。这种CAF-CD73hi状态在肿瘤进展和治疗过程中被动态调控和加强。研究人员认为，从治疗的角度来看，应考虑同时阻断CAF-A2B-CD73回路和ADO-A2A依赖的免疫抑制，从而实现持久的肿瘤控制。

参考文献：

Yu, M., Guo, G., Huang, L. et al. CD73 on cancer-associated fibroblasts enhanced by the A2B-mediated feedforward circuit enforces an immune checkpoint. Nat Commun 11, 515 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-