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【总览】各类免疫细胞表型概述
文章原创为：FACSelite 文章来源于：流式通
一般免疫亚群分析
General Immune Subset Profiling
流式细胞术常用于监测治疗或疾病进程对外周血细胞亚群和蛋白表达的影响，即免疫监测。该技术涉及表面蛋白标记，以评估成熟细胞亚群。更深入的分析可结合细胞因子和转录因子。对于高参数检测，推荐参考Cytometry Part B发布的OMIPs方案。
01.
骨干标记
Backbone Markers
全血的一般骨干标记包括：
CD34：造血干细胞和祖细胞
CD45：泛造血系标记
CD15或CD66b：PMN-MDSC，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞
CD14或CD33/CD11c：单核细胞
CD19：B细胞
CD56：NK和NKT细胞
CD3：T细胞
CD127：ILC
CD123：浆细胞样树突状细胞和嗜碱性粒细胞
TCRV α7.2：MAIT细胞
CD117：肥大细胞
包含CD34的目的是为了从分析中排除祖细胞，如果应用是白血病或其他血液相关恶性肿瘤，这可能非常重要，因为这些疾病是由淋巴母细胞的异常分裂引起的。同样，如果通过Ficoll分离去除了像中性粒细胞和嗜酸性粒细胞这样的多形核细胞，可能不需要CD66b或CD15。对于单核细胞的标记表型，另一种替代组合是使用CD33或CD64，而不是或除了CD14。
02.
T淋巴细胞
T Lymphocytes
T淋巴细胞分类概览：
T淋巴细胞的分类基于CD3阳性，并排除CD34、CD19和CD14。为了区分特定的T细胞亚群，需要检测以下标记：
γδ T细胞：γδTCR
MAIT细胞：TCRV α7.2
NKT细胞：TCRVα24-Jα18
CD56用于排除NKT和NK细胞，但需注意其在MAIT和γδT细胞上可能呈阳性或阴性。在分析时，应先对γδTCR、TCRV α7.2和TCRVα24-Jα18进行门控，再对CD56进行门控，以确保αβ T细胞的纯净度。
T细胞亚群的进一步分类：
CD4和CD8定义了T细胞的单阳性和双阳性亚群，并通过以下标记的表达进一步区分为幼稚、效应或记忆状态：
CD197
CD45RA
CD27
CD28
CD4+辅助性（Th）和CD8+细胞毒性（CTL或Tc）T细胞亚群通过以下组合来识别：
CCR10
CD183/CXCR3
CD185/CXCR5
CD194/CCR4
CD196/CCR6
这些表面标记最好与细胞内细胞因子或核转录因子的功能标记相结合，以增强分析的准确性。
特殊T细胞亚群：
T辅助滤泡（Tfh）细胞主要位于B细胞滤泡中心，由CXCR5+定义。滤泡调节性T（Tfr）细胞在表达CXCR5+方面与Tfh相似，但功能不同，主要调节B细胞的抗体反应。调节性T细胞（Treg）通常由CD25+/CD127lo/-定义，而Tfr细胞CD25/CD127的表达类似于Tregs。这些亚群的功能表型需要细胞因子或转录因子标记来进一步确认。先天淋巴细胞可能表达与T辅助和细胞毒性T细胞亚群相似的细胞因子和转录因子谱。
03.
自然杀伤细胞亚群标记
Natural Killer Subset Markers
自然杀伤（NK）细胞与NKT细胞的区别在于NK细胞不表达CD3，而CD94+有助于确认NK细胞的身份。NK细胞的进一步分类为成熟NK（NK1）、终末NK（NK2）和早期NK（NK3）依赖于CD56 (bright vs dim)、CD127、CD16和CD57的表达水平和模式。由于某些先天淋巴细胞也可能表达CD56，因此区分CD3-/CD127+的先天淋巴细胞（ILC）和CD3-/CD127lo/-的NK细胞是必要的。
04.
单核细胞
Monocytes
单核细胞和巨噬细胞概述：
- 单核细胞和巨噬细胞是免疫系统的关键组成部分，具有适应性和先天性免疫功能，主要负责清除微生物、肿瘤细胞和死亡细胞碎片。
- 单核细胞循环于血液中，而巨噬细胞主要驻留于组织中。
- 监测巨噬细胞时，可使用CD80（M1型）和CD206（M2型）标记。
单核细胞分类：
- 单核细胞约占白细胞的10%，通过CD3-/CD14+/CD11c+标记定义。
- 根据CD16和HLA-DR的表达水平，单核细胞分为三类：
经典型：(CD14 hi/CD16-/HLA-DR lo/CD11c lo)
中间型：(CD14 hi/CD16+/hi/ HLA-DR hi/ CD11c hi)
非经典型：(CD14 low/CD16 hi/ HLA-DR+/ CD11c hi)
- HLA-DR的检测有助于排除髓系来源的MSDC（Mo-MDSC），这些细胞表达CD3-/CD14+/CD16+/-HLA-DR-。
单核细胞功能：
- 经典型单核细胞占外周血中单核细胞的80-90%，具有抗微生物和促炎功能，能分泌活性氧和IL-10，并可分化为Mo-MDSC。
- 中间型单核细胞主要负责抗原呈递和凋亡调节。
- 非经典型单核细胞参与抗病毒反应和Fc受体介导的吞噬作用，通过CX3CR1在血管中巡逻并招募MHC II+细胞。
- 激活后，中间型和非经典型单核细胞分泌炎症细胞因子，如IL-6、TNF-alpha和IL-1 beta。
- 经典型和中间型单核细胞在功能上协同作用，受CCR2和CCR5指导侵入组织，分化为巨噬细胞或树突状细胞，并表达MHCII以激活T细胞。
05.
B细胞
B cells
B淋巴细胞概述：
- B淋巴细胞是适应性免疫系统的关键成员，通过CD45+/CD3-/CD19+的标记来识别。
- CD19比CD20更受青睐，因为它是B细胞祖细胞上首先表达的特异性标记，而CD20在抗体分泌细胞（如浆细胞和浆细胞前体细胞）上会丢失。
- B细胞高度异质化，需要产生多样化的抗原受体（BCR）以及记忆、天真和效应亚群。
- 类别转换是激活的B细胞改变其重链类型（从IgM和IgD到IgG、IgE或IgA）的过程，以优化对特定病原体的体液免疫反应，不影响抗体的特异性，只影响其效应功能。
- B细胞和T细胞受体的特异性在V(D)J重组过程中确定。
B细胞亚群的识别：
- 在B细胞特异性方案中，常用CD20、CD10、CD5、CD27、CD38、IgD、IgM、CD24的组合。
- 在一般免疫分析中，通过CD10、CD27和IgD的组合来区分记忆B细胞亚群。
B细胞标记的表达：
- CD27在约40%的外周B细胞中表达，是B细胞具有抗原特异性记忆和产生免疫球蛋白能力的标记，其在浆细胞抗体分泌细胞（ASC）上的表达增加。
- 存在一个CD27-的B记忆细胞亚群，称为双阴性（DN）细胞，其功能仍在研究中。
- CD10是指示淋巴细胞和NK细胞命运祖细胞分化程度和谱系承诺的标记。
- 在B细胞发育中，IgM首先在骨髓中的Pre-B II祖细胞上表达，而B细胞在离开骨髓成为过渡B细胞后才表达细胞表面IgD。
06.
粒细胞
Granulocytes
粒细胞是白细胞的一种，以其多叶核（多形核）、体积大（高前向散射FSC）和含有的蛋白质及酶颗粒（高侧向散射SSC）为特征。粒细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在流式细胞术中，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞和嗜酸性粒细胞有显著差异。
嗜碱性粒细胞：
嗜碱性粒细胞的散射特征较低，可能与单核细胞相似。
它们表达CD15或CD66b的水平低或不表达。
嗜碱性粒细胞的基本标记表型为CD45 lo/ CD3-/ CD14-/ CD66b-/CD123 hi。
嗜碱性粒细胞和浆细胞样树突状细胞（pDC）会落入同一群体，因此CD303+和HLA-DR+用于进一步定义pDC，而FcεR1a+用于定义嗜碱性粒细胞。
嗜碱性粒细胞占所有白细胞的1%，它们吞噬外来微生物，通过释放组胺调节过敏反应，通过释放肝素调节血液凝固。
中性粒细胞和嗜酸性粒细胞：
这两种细胞表达CD15和CD66b。
PMN-MDSC也表达CD15+/CD66b+，因此CD117+/Lox-1-可以识别中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，而CD177-/Lox-1+可以识别PMN-MDSC。
中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可以通过CD16和CD193的表达差异来区分。
中性粒细胞是感染的第一反应者，通过吞噬作用和吞噬体中的酶降解来破坏病原体。
嗜酸性粒细胞：
嗜酸性粒细胞占白细胞的1-5%，具有双叶核。
它们主要在血液循环或身体的脂肪组织中，保护身体免受寄生虫感染。
嗜酸性粒细胞迁移到炎症部位，并在寄生虫感染时释放含有麦芽糖结合蛋白（MBP）、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素（EDN）和促红细胞生成素（EPO）的颗粒。
这些细胞毒性蛋白混合物可以对感染周围的组织造成重大损害。
嗜酸性粒细胞可以通过CD193+来确认。
肥大细胞：
与嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞一样，肥大细胞（MC）也对FcεRIa阳性，这是一种结合单体IgE的表面受体。
骨干标记中包含CD117有助于通过其CD123-/ CD117 hi来表型肥大细胞，与其他CD3-/CD14-亚群相比较。
总结
Conclusion
流式细胞术中的免疫监测或免疫分析主要用于监测人类外周血中细胞亚群和蛋白表达的变化，涉及多种免疫细胞的表面标记，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和粒细胞等，以评估疾病进程或治疗效果。
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