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MagCapture™外泌体提取试剂盒PS

FUJIFILM Wako

293-77601

产品概述 技术指标 应用 配套产品 精彩视频 相关资料
详细描述:


2514694138412242.jpg新型亲和法外泌体提取试剂盒

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

 

  MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸(PS)亲和Tim4蛋白固化磁珠(PS亲和法)的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡(EVs)。如果想要得到更高纯度的外泌体,请使用10,000×g离心后的上清。

  该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来,所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验,包括电镜分析(TEM)、纳米粒子追踪(NTA)分析、投喂实验、分子组成(蛋白质、脂质、核酸等)分析等。

 


◆膜表面磷酯酰丝氨酸(PS)亲和法


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  Tim4蛋白固化磁珠,在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸(PS),然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱,捕获高纯度的完整细胞外囊泡



◆优点・特色


 nezumi-1[1]-cn.jpg

 

使用新型亲和提取方法


● 通过PS亲和分子回收

● 低背景值

● 在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱

※ 可获得高纯度,完整的外泌体

捕获.JPG


无需进行超离

● 使用磁珠改进了操作

● 流程优化

※ 高重复性


2014532734317504.gif

与其他提取方法相比

方法

外囊泡纯度

囊泡状态

可操作性

回收量

PS亲和法

■■■

完整

简便稳定

■■■

超速离心法

■■

完整

简便

■■

聚合物沉淀法

完整

简便快捷

■■■■

密度梯度离心法

■■■■

完整

复杂

■■

抗体亲和法

■■■

不完整

简便稳定

■■

样品类型:细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。


● 可以纯化高纯度完整的细胞外囊泡

● 可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

● 重复性高,回收量稳定

● 简易操作(约3.5小时)

● 启用多个样品(无需超速离心)



产品列表


产品名称

包装规格

保存条件

MagCapture™
Exosome Isolation Kit PS

10次

(产品编号:293-77601)

2次

(产品编号:299-77603)

2-10°C

试剂盒成分

(1) 链霉亲和素磁珠
(2)生物素标记的外泌体捕获
(3)外泌体捕获免疫固定缓冲液
(4)外泌体结合增强剂(×500)
(5)洗涤缓冲液
(6)外泌体洗脱缓冲液
(7)反应管

<10 次>
 600 μL×1 管
 100 μL×1 管
 35 mL×1 瓶
 500 μL×1 管
 75 mL×2 瓶
 5 mL×1 瓶
 22 管

<2 次>
 120 μL×1 管
 20 μL×1 管
 7 mL×1 瓶
 100 μL×1 管
 30 mL×2 瓶
 1 mL×1 瓶
 1 管

 *每套试剂盒能完成5次回收实验,即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit



案例•应用


从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析


从人血清中提取外泌体的产量比较

  使用该试剂盒,超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体,接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。


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● 检测抗体

      抗CD9兔多抗,System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗,System Bioscience公司

● 免疫印迹(WB)数据

      各样品结果相当于150μL的血清样本。从100μL提取物中取出15μL,添加5μL的4×SDS样品缓冲液,全部上样。

 

从人EDTA血浆中提取外泌体

  分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆(超滤更换缓冲液)、人血清中提取外泌体,进行WB检测(抗Flotillin2抗体)。

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● 检测抗体

      抗Flotillin-2小鼠单抗(29/Fotillin-2),BD Bioscience公司

● 使用样品量

      各1mL

● 免疫印迹(WB)数据

      各样品结果分别对应150μL样品量。从100μL提取物中取出15μL,添加5μL的 4×SDS样品缓冲液,全部上样。

 

从人尿液中提取外泌体的回收量比较

  1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收,并做免疫印迹(WB)检测(抗CD9抗体)。


4.png


● 检测抗体

      抗CD9兔多抗,System Biosciences公司

● 使用样品量

      各1mL

● 免疫印迹(WB)数据

      各样品结果分别对应150μL尿液样品。从100μL提取物中取出15μL,加入5μL的 4×SDS样品缓冲液,全部上样。

 


◆与传统沉淀法的功能比较实验


  分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562(人慢性骨髓性白血病)细胞培养上清(无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基)提取外泌体,分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。


MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】


  按照试剂盒的操作说明(反应时间:3小时),从1mL经过离心处理(10,000×g,30min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)中提取外泌体。

超速离心法

  将10mL经过离心处理(10,000×g,30min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)进行超离(110,000×g,70min),用TBS缓冲液重悬沉淀物后,再进行超离(110,000×g,70min),回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

  从1mL经过离心处理(10,000×g,30min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)中,按照市售的A公司产品的操作说明(静置时间:过夜)提取外泌体。

※1:110,000×g离心2小时,在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比较提取的外泌体的透射电子显微镜(TEM)分析结果和纳米粒子追踪(NTA)分析结果

  分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体,用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外,用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段(2~4×1010 particles),在透射电子显微镜进行分析。


5.png

电子显微镜图像 数据提供:金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生


MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子,在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。

 

K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较(无血清培养基)

  用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清(无血清培养基)获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法(CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体)进行实验。



6.jpg


6.5.jpg

回收量,不是回收率

● 检测抗体

     抗CD63小鼠单抗(MEM-259)

     抗Flotillin-2 小鼠单抗  (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗 (25/Lamp-1),BD Bioscience公司

 


K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较(10%FBS-添加培养基)


  用MagCapture™外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法,从K562 细胞培养上清(10% 去外泌体 FBS补充培养基)获得样品进行电泳,用银染法和WB法(CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体)进行实验。同时,对外泌体提取片段进行质谱测定,比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例(由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的,所以人来源多肽的比率会下降)。


7.png


● 检测抗体

     抗CD63小鼠单抗(MEM-259)

     抗Flotillin-2小鼠单抗 (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司

     健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较


实验数据

①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量

通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离,然后使用microRNA提取试剂盒(产品编号295-71701)提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA,并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。


8.png

相比超离法,PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。


②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较

  运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离,然后使用microRNA提取试剂盒(产品编号295-71701)或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA,并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。


9.png

对比AGPC法,使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA


◆外泌体蛋白质组学分析


<实验内容及结果>

  分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法,从含10% FBS(不含外泌体)的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离,剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化,用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。

比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质

白色柱:源自外囊泡的人类蛋白质

灰色柱:来自FBS的牛蛋白污染物

红 色:来自外囊泡的标记蛋白

样品:K562细胞培养基(含有10%去除外泌体胎牛血清)



PS亲和法

超离法

聚合物沉淀法

1

71kDa热休克同源蛋白

(Heat shock cognate 71kDa protein)

DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因

(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)

补体C3

(Complement C3)

2

膜联蛋白A6

(Annexin A6)

铁转蛋白受体1

(Transferrin receptor protein1)

α2-巨球蛋

(Alpha-2-macroglobulin)

3

铁转蛋白受体1

(Transferrin receptor protein1)

血清白蛋白

(Serum albumin)

纤连蛋白

(Fibronectin)

4

V-ATP酶A亚基

(V-type proton ATpase catalytic subunit A)

ATP依赖RNA解旋酶

(ATP-dependent RNA helicase A)

血清白蛋白

(Serum albumin)

5

浮舰蛋白-2

(Flotillin-2)

微管蛋白β5

(Tubulin beta-5 chain)

血小板反应蛋白-1

(Thrombospondin-1)

6

程序性细胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)

71kDa热休克同源蛋白

(Heat shock cognate 71kDa protein)

补体C4

(Complement C4)

7

细胞表面抗原4F2重链

(4F2 cell-surface antigen heavy chain )

脂肪酸合成酶

(Fatty acid synthase)

α-1抗蛋白酶

(Alpha-1-antiproteinase)

8

膜联蛋白A1

(Annexin A1)

细胞表面抗原4F2重链

(4F2 cell-surface antigen heavy chain)

载脂蛋白-β-100

(Apolipoprotein-β-100)

9

220kDa激酶D相互作用底物

(Kinase D-interacting substrate of 220kDa)

U5小核核糖核蛋白的解旋酶

(U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)

胎儿血红蛋白亚单位

(Hemoglobin fetal subunit beta)

10

膜联蛋白A2

(Annexin A2)

β4微管蛋白

(Tubulin beta-4B chain)

β5微管蛋白

(Tubulin beta-5 chain)

10.5.png

成对组合相关性比较


10.png

 


应用数据


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Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度


  Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸(BCA)定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒,是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为,碱性条件下的蛋白质Cu2+离子被还原为Cu+。Cu+与BCA形成络合物,即产生紫色螯合物,蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关,通过测定562nm处的吸光度,并与标准曲线做比照,即可定量溶液中的蛋白质浓度。

利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体,通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。


【实验内容及结果】

  将通过MagCapture™外泌体提取试剂盒提取的25μL外泌体溶液分注于96孔板中,加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200μL。之后60℃孵育30分钟,检测560nm吸光度(图1)。结果表明,通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测,可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

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图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌体蛋白质浓度相当低,因此BCA测定时不要稀释样品。

①    将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL和空白对照,分别每孔25μL加到96孔板中。

②    分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液(空白)按照每孔25μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit(产品编号:297-73101)的试剂A盒试剂B混合液(A:B=50:1)加入放有样品的孔板中。

④    60℃孵育30分钟

⑤    室温条件下降低孔板温度

⑥    测定560nm的吸光度

 

产品编号

产品名称

包装

297-73101

Protein Assay BCA Kit

蛋白测定试剂盒(二喹啉甲酸)

250次用

015-25613

2 mg/mL Albumin Solution   from Bovine Serum

2mg/mL 牛血清蛋白溶液

1mL×10

 


◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验


【实验概要】

用PKH67(Sigma公司)标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡, Hela细胞导入确认


<外泌体PKH67标记>

1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体(实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体)

2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度

3. 将相当于5μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5mL管中。

*请配制合适的使用量

4. 将2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*请配制合适的使用量

5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中,混合后在室温中孵育5-10分钟。

6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns (MW 3000)(Thermo公司)。

7. 将100μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中,离心(最大添加量:100μL)。

*准备必需的支数。

8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中,24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。

*根据实验调节外泌体添加量


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图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察


从16mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4mL培养上清液作为样品,通过PS亲和法提取外泌体。

●      提取的外泌体蛋白质浓度:22.3ng/μL

●      粒子浓度:1.2×108 particles/mL

将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中,24小时后用荧光显微镜(左)和流式细胞仪(右)检测捕获情况。

Opti-MEM:取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。


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◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作


  样品预处理:对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体,则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。

  下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作,请参考血清/血浆的实验步骤,做适当调整。


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更换缓冲液(限制过滤)操作

用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。

1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20(100K)中。

2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20(100K)中,

 混匀。

3. 把第2. 的VivaSpin20(100K)在4℃下进行离心处理。

4. 减少上线的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 缓冲液。

5. 4℃下离心处理。

6. 减少上面的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 缓冲液。

7. 4℃下离心处理。

8. 减少上面的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加11 mL TBS 缓冲液。

9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。

10. 进行提取。

 


◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤


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更多应用说明,请点击:

新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

外泌体与肿瘤细胞转移及恶化的关联


欲了解相关产品请点击文字:

EV-Save™ 细胞外囊泡封闭试剂

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◆膜表面磷酯酰丝氨酸(PS)亲和法


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  Tim4蛋白固化磁珠,在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸(PS),然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱,捕获高纯度的完整细胞外囊泡



 

  MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸(PS)亲和Tim4蛋白固化磁珠(PS亲和法)的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡(EVs)。如果想要得到更高纯度的外泌体,请使用10,000×g离心后的上清。

  该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来,所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验,包括电镜分析(TEM)、纳米粒子追踪(NTA)分析、投喂实验、分子组成(蛋白质、脂质、核酸等)分析等。

 

货号 名称 品牌 购买

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PS亲合法

  通过使用T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域包含蛋白4Tim4)分离高度纯化的外泌体。Tim4是在巨噬细胞上表达的I型跨膜蛋白,其强烈结合磷酯酰丝氨酸,不仅显示在凋亡细胞上,而且显示在外泌体和微泡。使用Tim4蛋白,其特异性结合显示在外泌体表面上的磷酯酰丝氨酸。因为结合是Ca2+依赖性的,完整的外泌体可以通过添加Ca2+螯合剂容易地从Tim 4释放。值得注意的是,利用PS亲和法提取的外泌体纯度之高可以用过质谱显示的。还用于从细胞条件培养基沉淀中分离大外泌体和通过ELISA、流式细胞术对外泌体的灵敏定量。这些结果表明通过Tim4蛋白纯化的有用性表征Evs的真正功能。

Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935



封面1.png

和光外泌体提取试剂盒宣传页

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Wako外泌体英文版说明书.pdf



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成功研发提取高纯度外泌体方法

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MagCapture™ 外泌体提取试剂盒中文说明书



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Exosome外泌体提取试剂盒.pdf






操作流程



样品制备流程(步骤1)


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b1.jpg



外泌体捕获固定流程(步骤2)



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亲和提取流程(步骤3—5)


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外泌体提取血浆样品前处理步骤


使用TBS缓冲液进行缓冲液交换

1、向VIVASPIN 20(100K)中添加19mL TBS缓冲液。

2、将1ml血浆添加到(步骤1)的VIVASPIN 20(100K)中并混合。

3、离心(步骤2)中的VIVASPIN 20(100K)。 (离心条件参考使用说明书)

4、当上层液体下降时,添加10mL TBS缓冲液到(步骤3)的VIVASPIN 20(100K)中。

5、离心。

6、当上层液体下降时,添加10mL TBS缓冲液到(步骤5)的VIVASPIN 20(100K)中。

7、离心。

8、当上层液体下降时,添加11mL TBS缓冲液到(步骤7)的VIVASPIN 20(100K)中。

9、离心VIVASPIN 20(100K),直到样品体积变为1mL。

该方案共计使用50mL的TBS缓冲液。




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