产品中心
技术交流
扫描二维码
MagCapture™外泌体提取试剂盒PS
FUJIFILM Wako
293-77601
新型亲和法外泌体提取试剂盒
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。
该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。
◆膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法
Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡
◆优点・特色
![nezumi-1[1]-cn.jpg](/Public/image/20190225/1551077533244262.jpg "1914531675721869.jpg")
使用新型亲和提取方法
● 通过PS亲和分子回收 ● 低背景值 ● 在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱 ※ 可获得高纯度，完整的外泌体 |
|
无需进行超离
● 使用磁珠改进了操作
● 流程优化
※ 高重复性
与其他提取方法相比 | ||||
方法 | 外囊泡纯度 | 囊泡状态 | 可操作性 | 回收量 |
PS亲和法 | ■■■ | 完整 | 简便稳定 | ■■■ |
超速离心法 | ■■ | 完整 | 简便 | ■■ |
聚合物沉淀法 | ■ | 完整 | 简便快捷 | ■■■■ |
密度梯度离心法 | ■■■■ | 完整 | 复杂 | ■■ |
抗体亲和法 | ■■■ | 不完整 | 简便稳定 | ■■ |
样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。
● 可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡
● 可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡
● 重复性高，回收量稳定
● 简易操作（约3.5小时）
● 启用多个样品（无需超速离心）
◆产品列表
产品名称 | 包装规格 | 保存条件 | |
MagCapture™ | 10次 （产品编号：293-77601） | 2次 （产品编号：299-77603） | 2-10°C |
试剂盒成分 (1) 链霉亲和素磁珠 | <10 次> | <2 次> | |
*每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit
◆案例•应用
从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析
从人血清中提取外泌体的产量比较
使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。
● 检测抗体
抗CD9兔多抗，System Bioscience公司
抗CD63兔多抗，System Bioscience公司
● 免疫印迹（WB）数据
各样品结果相当于150μL的血清样本。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS样品缓冲液，全部上样。
从人EDTA血浆中提取外泌体
分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行WB检测（抗Flotillin2抗体）。
● 检测抗体
抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司
● 使用样品量
各1mL
● 免疫印迹（WB）数据
各样品结果分别对应150μL样品量。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。
从人尿液中提取外泌体的回收量比较
1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗CD9抗体）。
● 检测抗体
抗CD9兔多抗，System Biosciences公司
● 使用样品量
各1mL
● 免疫印迹（WB）数据
各样品结果分别对应150μL尿液样品。从100μL提取物中取出15μL，加入5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。
◆与传统沉淀法的功能比较实验
分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】
按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中提取外泌体。
超速离心法
将10mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70min），用TBS缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70min），回收沉淀部分。
聚合物沉淀法
从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。
※1：110,000×g离心2小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。
比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果
分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外，用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（2~4×1010 particles），在透射电子显微镜进行分析。
电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生
MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。
K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）
用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体）进行实验。
回收量，不是回收率
● 检测抗体
抗CD63小鼠单抗（MEM-259）
抗Flotillin-2 小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
抗Lamp-1小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司
K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10%FBS-添加培养基）
用MagCapture™外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。
● 检测抗体
抗CD63小鼠单抗（MEM-259）
抗Flotillin-2小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司
健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较
实验数据
①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量
通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。
②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较
运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA
◆外泌体蛋白质组学分析
<实验内容及结果>
分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含10% FBS（不含外泌体）的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。
比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质
白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质
灰色柱：来自FBS的牛蛋白污染物
红 色：来自外囊泡的标记蛋白
样品：K562细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）
PS亲和法 | 超离法 | 聚合物沉淀法 | |
1 | 71kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein) | DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) | 补体C3 (Complement C3) |
2 | 膜联蛋白A6 (Annexin A6) | 铁转蛋白受体1 (Transferrin receptor protein1) | α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin) |
3 | 铁转蛋白受体1 (Transferrin receptor protein1) | 血清白蛋白 (Serum albumin) | 纤连蛋白 (Fibronectin) |
4 | V-ATP酶A亚基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A) | ATP依赖RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A) | 血清白蛋白 (Serum albumin) |
5 | 浮舰蛋白-2 (Flotillin-2) | 微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain) | 血小板反应蛋白-1 (Thrombospondin-1) |
6 | 程序性细胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein) | 71kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein) | 补体C4 (Complement C4) |
7 | 细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain ) | 脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase) | α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase) |
8 | 膜联蛋白A1 (Annexin A1) | 细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain) | 载脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100) |
9 | 220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa) | U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase) | 胎儿血红蛋白亚单位 (Hemoglobin fetal subunit beta) |
10 | 膜联蛋白A2 (Annexin A2) | β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain) | β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain) |
成对组合相关性比较
◆应用数据
Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度
Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质Cu2+离子被还原为Cu+。Cu+与BCA形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定562nm处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。
利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。
【实验内容及结果】
将通过MagCapture™外泌体提取试剂盒提取的25μL外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200μL。之后60℃孵育30分钟，检测560nm吸光度（图1）。结果表明，通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。
图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测
<BCA Assay 操作概要>
由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此BCA测定时不要稀释样品。
① 将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg／mL和空白对照，分别每孔25μL加到96孔板中。
② 分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔25μL加入96孔板。
③ 把200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂A盒试剂B混合液（A:B=50:1）加入放有样品的孔板中。
④ 60℃孵育30分钟
⑤ 室温条件下降低孔板温度
⑥ 测定560nm的吸光度
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
Protein Assay BCA Kit 蛋白测定试剂盒（二喹啉甲酸） | 250次用 | |
2 mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液 | 1mL×10 |
◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验
【实验概要】
用PKH67（Sigma公司）标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela细胞导入确认
<外泌体PKH67标记>
1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体）
2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度
3. 将相当于5μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5mL管中。
*请配制合适的使用量
4. 将2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*
*请配制合适的使用量
5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中，混合后在室温中孵育5-10分钟。
6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。
7. 将100μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（最大添加量：100μL）。
*准备必需的支数。
8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中，24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。
*根据实验调节外泌体添加量
图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察
从16mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4mL培养上清液作为样品，通过PS亲和法提取外泌体。
● 提取的外泌体蛋白质浓度：22.3ng/μL
● 粒子浓度：1.2×108 particles/mL
将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。
Opti-MEM：取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。
◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作
样品预处理：对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。
下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。
更换缓冲液（限制过滤）操作
用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。
1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20（100K）中。
2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，
混匀。
3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下进行离心处理。
4. 减少上线的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。
5. 4℃下离心处理。
6. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。
7. 4℃下离心处理。
8. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 缓冲液。
9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。
10. 进行提取。
◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤
更多应用说明，请点击：
欲了解相关产品请点击文字：
PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）
相关资料
◆膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法
Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。
该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。
| 货号 | 名称 | 品牌 | 购买 |
|---|
【相关资料】
PS亲合法
通过使用T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域包含蛋白4（Tim4）分离高度纯化的外泌体。Tim4是在巨噬细胞上表达的I型跨膜蛋白，其强烈结合磷酯酰丝氨酸，不仅显示在凋亡细胞上，而且显示在外泌体和微泡。使用Tim4蛋白，其特异性结合显示在外泌体表面上的磷酯酰丝氨酸。因为结合是Ca2+依赖性的，完整的外泌体可以通过添加Ca2+螯合剂容易地从Tim 4释放。值得注意的是，利用PS亲和法提取的外泌体纯度之高可以用过质谱显示的。还用于从细胞条件培养基沉淀中分离大外泌体和通过ELISA、流式细胞术对外泌体的灵敏定量。这些结果表明通过Tim4蛋白纯化的有用性表征Evs的真正功能。
（Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935）
|
|
 |
|
|
操作流程
样品制备流程（步骤1）
![protocol[3]-cn.jpg](/Public/image/20190225/1551078594859802.jpg "0814653747671398.jpg")
外泌体捕获固定流程（步骤2）
亲和提取流程（步骤3—5）
外泌体提取血浆样品前处理步骤
使用TBS缓冲液进行缓冲液交换
1、向VIVASPIN 20（100K）中添加19mL TBS缓冲液。
2、将1ml血浆添加到（步骤1）的VIVASPIN 20（100K）中并混合。
3、离心（步骤2）中的VIVASPIN 20（100K）。 （离心条件参考使用说明书）
4、当上层液体下降时，添加10mL TBS缓冲液到（步骤3）的VIVASPIN 20（100K）中。
5、离心。
6、当上层液体下降时，添加10mL TBS缓冲液到（步骤5）的VIVASPIN 20（100K）中。
7、离心。
8、当上层液体下降时，添加11mL TBS缓冲液到（步骤7）的VIVASPIN 20（100K）中。
9、离心VIVASPIN 20（100K），直到样品体积变为1mL。
该方案共计使用50mL的TBS缓冲液。
粤公网安备 44010602000473号
粤ICP备09063491号
营业执照
