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腺相关病毒
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重组腺相关病毒（AAV）是一种在体外或体内实验中均被广泛使用的病毒载体。AAV可以转导大量类型的哺乳动物细胞，并且在人体中表现为无致病性和低免疫原性，这些特点使其成为当前应用于基因治疗领域中其中一种最高效的基因递送载体。云舟生物提供高质量的AAV病毒包装服务，可以满足AAV基因治疗相关的实验需求。我们开发出一系列专有技术，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了AAV病毒包装工艺水平，特别是经由我们设计的AAV载体。我们的AAV病毒具有良好的客户评价。我们除了可以提供科研级的AAV病毒包装服务外，还可以提供用于临床应用的GMP级别AAV制备服务。
我们的科研级AAV病毒包装服务可以满足多样的AAV基因递送实验需求。您可以选择三质粒转染法包装AAV或者使用昆虫杆状病毒生产AAV。
| 生产规格 | 应用 | 典型滴度 | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
| ssAAV病毒⼩量制备 | 细胞培养 | > 1012 GC/ml | > 2 x 1011 GC/ml | 10 x 25 ul | ￥3,100.00 | 10-18天 |
| ssAAV病毒中量制备 | 10 x 100 ul | ￥4,600.00 | ||||
| ssAAV病毒大量制备 | > 5 x 1012 GC/ml | > 2 x 1012 GC/ml | 10 x 100 ul | ￥7,700.00 | ||
| 超纯化ssAAV病毒⼩量制备 | 细胞培养和体内应用 | > 2 x 1013 GC/ml | > 1013 GC/ml | 4 x 25 ul | ￥9,300.00 | 16-26天 |
| 超纯化ssAAV病毒中量制备 | 10 x 50 ul | ￥11,300.00 | ||||
| 超纯化ssAAV病毒⼤量制备 | 10 x 100 ul | ￥16,900.00 | ||||
| 超纯化ssAAV病毒超⼤量制备 | 10 x 500 ul | ￥61,900.00起 | 30-40 天 | |||
| 超纯化ssAAV病毒特⼤量制备 | 10 x 1 ml | ￥108,300.00起 | 40-50 天 | |||
| 其它规格 | 请咨询 | |||||
提示：
1. GC = Genome copies。
2. 三质粒转染法包装AAV适用于以下血清型：1、2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF和AAV2.7m8。
3. AAV血清型3、4、6、6.2、2.7m8的滴度通常偏低。对于这些血清型我们保证其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
4. 对于超纯化AAV病毒，病毒颗粒经过CsCl梯度密度离心纯化。
5. 典型滴度可在～70%的病毒包装项目中实现。典型滴度非保证滴度。
我们提供的AAV类型
单链AAV（Single-stranded AAV，ssAAV）和自互补AAV（Self-complementary AAV，scAAV）
18种血清型：1、 2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF和AAV2.7m8
AAV空壳和类病毒颗粒（Virus-like particle，VLP)
我们提供的AAV的包装服务涵盖以下血清型：
按照血清型分类
按照组织嗜性分类
| 组织 | 推荐使用的AAV血清型 |
| 平滑肌 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 中枢神经系统 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB |
| 外周神经系统 | AAV-PHP.S |
| 脑 | AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8 |
| 视网膜 | AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8 |
| 内耳组织 | AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8 |
| 肺 | AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10 |
| 肝 | AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 胰腺 | AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10 |
| 心脏 | AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ |
| 肾 | AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脂肪组织 | AAV6, AAV8, AAV9 |
| 睾丸 | AAV2, AAV9 |
| 脾 | AAV-DJ, AAV-DJ/8 |
| 脊神经 | AAV2-retro |
| 内皮细胞 | AAV2-QuadYF |
注意：携带目的基因的转移质粒上的ITR序列来自于AAV2。一般来说，包装不同血清型的AAV，指的是使用不同血清型的衣壳蛋白表达质粒，与携带AAV2 ITR的转移质粒进行包装。
查看不同腺相关病毒血清型病毒衣壳蛋白1（VP1）的氨基酸序列 >>
ssAAV
scAAV
昆虫杆状病毒生产AAV
| 纯化AAV制备服务（通过杆状病毒转导Sf9昆虫细胞制备） | |
| 交付内容 | 定制病毒，按照规格交付：
|
对照病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
| |
| 病毒重悬液 | pH7.4 PBS缓冲液（添加200 mM NaCl和0.001% pluronic F-68） |
| 运输/存储 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 |
| 推荐应用 | 体外培养细胞转导、动物体内细胞转导 |
对照病毒
为了更好地开展您的实验，我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如，如果定制病毒表达一个基因，则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA，则对照病毒表达一个Scramble shRNA。推荐的对照病毒信息如下表所示：
| 对照病毒 | 对照载体名称 | 对照载体ID | 定制病毒 |
| 超纯化EGFP对照AAV病毒，杆状病毒感染Sf9方法 | pBV-ITR-CMV>EGFP-ITR | VB010000-9306ded | 哺乳动物基因表达AAV病毒（通过杆状病毒转导Sf9昆虫细胞制备） |
我们的AAV病毒存储在特殊的Tris缓冲液或PBS缓冲液中，并采用干冰运输。收到AAV病毒后，立即放置于-80℃，可保存约一年。若放置于-20℃，则可保存2-3周。融解后的AAV病毒可在4℃保存1-2周。虽然AAV病毒比其他多数病毒稳定（如慢病毒），但是也请避免反复冻融，因为这会导致AAV病毒滴度显著下降。
下表比较了我们不同级别的AAV病毒。
| 科研级（非纯化） | 科研级（超纯化） | 科研级Plus | |
| 纯化方式 | - | CsCl梯度密度离心 | CsCl梯度密度离心（默认） 碘克沙醇梯度密度离心（可选） 亲和层析色谱（可选） 离子交换色谱（可选） |
| 滴度 | > 1012 GC/ml | > 1013 GC/ml | 1 x 1013 - 5 x 1013 GC/ml |
| 纯度（SDS-PAGE） | - | > 80% | > 90% |
| 内毒素水平 | < 30 EU/ml | < 10 EU/ml | < 2 EU/ml |
| 完整衣壳比率 | - | > 70% | > 80% |
三质粒转染法生产AAV
昆虫杆状病毒生产AAV
| 步骤 | 描述 | 时间 |
Triple-transfection | 我们常规使用的helper-free腺相关病毒包装系统包括1个转移质粒（Transfer plasmid）、1个Rep和Cap表达质粒（Rep-Cap plasmid）和1个辅助质粒（Helper plasmid），其包装过程是将携带目的基因（Gene of Interest， 简称GOI）和ITR序列的转移质粒、表达特定血清型衣壳蛋白的Rep-Cap质粒和编码介导腺相关病毒复制的腺病毒基因（E2、E2A和VA）的辅助质粒共转染HEK293T包装细胞，这个转染过程称为三质粒转染（Triple-transfection）。 | 第1天 |
Supernatant collection | 在细胞里，转导质粒表达包含目的基因（Gene of Interest, GOI）的AAV基因组，Rep-Cap质粒表达特定血清型的AAV衣壳蛋白，辅助质粒表达辅助AAV基因组表达翻译的组分。三者共同作用从而在细胞中生成完整的AAV病毒颗粒。细胞短暂孵育后，根据血清型的不同，收集上清或者细胞裂解液获取病毒颗粒 | 第3天 |
Concentration and purification | PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化腺相关病毒（体内应用级别），再通过氯化铯（CsCl）密度梯度离心对病毒颗粒进一步纯化和浓缩。 | 第5天 |
Quality Control | 对病毒采用ITR qPCR方法进行滴度测定（Titer determination）、并且还进行微生物检测（Bioburden test，针对细菌、真菌）、支原体检测（Mycoplasma test）等。 若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化AAV病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度（Virus purity test）。 | 第7天及以后 |
下表展示了我们可提供的AAV QC方法。
| 其它可选购的QC服务 | 方法 |
| 滴度检测 | ddPCR |
| TCID50 | |
| AAV复制能力检测 | qPCR |
| 完整衣壳/空衣壳分析 | TEM |
| CDMS | |
| SV-AUC |
我们的滴度保证仅适用于包装进病毒的区域（从5’ ITR到3’ ITR）小于腺相关病毒承载限度（4.7 kb，～野生型AAV2基因组长度）的载体。超过该范围，超出4.7 kb的那部分序列在包入衣壳时会被剪切掉，导致包装出来的AAV病毒颗粒含有不完整的基因组，不仅影响ITR qPCR滴度检测，而且影响转基因表达。此外，对于如下情况，我们同样不能保证滴度：
AAV血清型3、4、6、6.2、2.7m8的滴度通常偏低。对于这些血清型我们保证其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
包含对包装过程有不利影响的序列，例如毒性基因（如促凋亡基因）；破坏包装细胞或病毒的完整性（如导致细胞聚集的膜蛋白）的基因 ；易于重排或者产生二级结构的序列（如重复序列或者高GC含量序列）。
⽤户提供的载体，因为我们无法控制载体质量。
如需客户提供AAV病毒载体，则请按照外来物品接收指南将载体寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。
三质粒转染法生产的AAV
我们开发了一系列专有技术用以优化三质粒转染法包装AAV的效率。我们的三质粒转染法包装的AAV在哺乳动物细胞中表现出很高的转导效率。
图1 向HEK293T细胞转导18种血清型的重组AAV病毒，这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体（VB010000-9394npt）。转导后48小时的EGFP表达效果如下图所示。比例尺：100 um。
杆状病毒生产的AAV
我们开发了一系列专有技术用于优化我们的杆状病毒生产AAV的流程。我们的杆状病毒生产的AAV在转导哺乳动物细胞时表现出良好的转导效率。
图4 表达EGFP的杆状病毒生产的AAV转导HEK293T细胞，血清型为AAV1和2，MOI 10000。左：明场。右：EGFP。
| 货号 | 名称 | 品牌 | 购买 |
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