AAV-CRISPR基因编辑

       派真生物载体克隆提供基因编辑CRISPR系列载体定制，AAV-CRISPR载体的敲除、修复共分为4种类别，分别是SpCas9/SpCas9HF（A、B系列）、SaCas9/ SaCas9HF（C、D系列）、AAV-CRISPR基因激活（E系列）、NmCas9, AsCpf1, LbCpf1（F、G、H系列），专门用于基因编辑动物体内实验。

基本描述

       客户只需要提供sgRNA靶基因序列和选择派真生物载体库编号，由派真生物进行靶点设计、图谱制作和载体构建，若gRNA未经有效性验证，建议多选择2-3个候选靶点。

SpCas9/SpCas9HF（A、B系列）

       SpCas9是第一个被鉴定的CIRSPR核酸酶，其PAM为NGG，PAM序列在基因中出现的频率，大约每8bp出现一次，基因长达4.2Kb（详细介绍请参阅AAV-CRISPR系统，第18页）。派真生物以小于300 bp的EFS（EF1a短版本）启动子或miniCMV启动子（180 bp）驱动SpCas9，使序列总长度不超过 AAV长度限制 5Kb。

特点

• 使用经过优化的sgRNA scaffold，能提高切割效率约40%SpCas9HF: SpCas9高保真度版本，大大减小脱靶现象，切割活性与野生型相比无显著降低；
• XA01为SpCas9及sgRNA表达盒处在同一载体的一体化载体。使用比U6启动子更小但活性并无显著减弱的H1启动子(100 bp)，因此能将sgRNA的表达盒与SpCas9放入同一载体；
• XA02为无sgRNA表达盒的单独SpCas9载体，可根据需要置换EFS启动子成410 bp以下的启动子；
• XA03~XA27为U6-sgRNA表达盒，带有EFS或EF1或CAG启动子驱动的mCherry、Cre、mCherry-2A-Cre、RenillaLuciferase-2A-Cre、ZsGreen、EGFP、EGFP-KASH。

特点

• 使用了经优化的sgRNA scaffold, 显著提高切割效率；
• C1/D1为CMV启动子的SaCas9HF与sgRNA表达盒一体化载体；
• C2/D2/C2XX/D2XX为无sgRNA表达盒的单独SaCas9/SaCas9HF载体，可根据实验设计需要搭配不同的载体使用。

AAV-CRISPR基因激活（E系列）

       在14-16 nt的短RNA指导下，野生型SpCas9能结合到靶序列DNA上但不能切割与释放。此时，经过改造加入形成MS2 RNA接头的sgRNA骨架能结合MS2-P65-HSF1 转录激活成分，从而激活下游位置的基因转录。激活基因的转录水平能达1000倍以上。

       NmCas9 是跟SpCas9有相似活性的短版本Cas9，基因长度为3.3kb，由于识别更长的PAM（NNNNGATT），PAM序列在基因中出现的频率，大约每128 bp中出现一次，靶序列长度为（21-23 nt)，理论脱靶率比SpCas9低得多，AsCpf1、LbCpf1拥有与 CRISPR-Cas9不一样的特性：（1）更短小的sgRNA骨架（2）识别含T量高的5’PAM（3）靶标DNA被切于远离PAM的位置，且产生5个碱基突出的粘末端。

*如需其他类型启动子或骨架定制，请联系技术支持。