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详细描述:
重组蛋白表达 纯化目的蛋白通常对于确定该蛋白功能、结构或相互作用、产生特异性抗体或制备用于实际应用的酶是必不可少的。从其原始来源对天然表达的蛋白进行分离可能是一个涉及许多色谱步骤的复杂过程。在专用宿主生物体中对重组蛋白进行表达可以极大地简化该任务。此类表达系统通常可确保更高的表达水平。将靶蛋白与一种标签进行融合,便于使用亲和基质与之结合进行纯化。使用固定化Ni2+对蛋白进行纯化蛋白亲和纯化中更常用的技术是将6至14个组氨酸的序列设计到蛋白质的N-或C-末端(或甚至在暴露的环上)。这些延伸的多组氨酸可与二价金属离子如镍和钴发生强烈结合。这种结合效应可应用于蛋白的分离。金属离子可通过螯合剂固定于基质上,这使得这些离子仍然可以与蛋白质上的多组氨酸标签进行结合。当这些带有组氨酸标签的蛋白质通过含有固定化金属离子的色谱柱时,蛋白则会通过标签与色谱柱进行结合。然而,几乎所有未被标记的蛋白质则都会穿过色谱柱。通过用咪唑(能与多组氨酸标签竞争性的与柱结合)或通过降低pH(这降低了标签对树脂的亲和力)将蛋白从柱中洗脱出来。虽然这种方法通常用于纯化具有工程亲和标签的重组蛋白,但它也可用于对二价阳离子具有固有亲和力的天然蛋白质。组氨酸标签 理想情况下,经组氨酸标记的靶蛋白对于Ni2+螯合基质的结合能力,相较于表达宿主中含有内源性组氨酸的蛋白来说结合能力更强。相对结合强度取决于有多少组氨酸可以同时结合至基质上(亲合力效应)。更长的组氨酸标签可赋予蛋白更强的结合能力,并可更好地分离目标蛋白与潜在的宿主杂蛋白。经典的组氨酸标签包含六个连续的组氨酸。具有10至14个组氨酸的标签可以获得更好的纯化效果。最重要的是,组氨酸标记的蛋白质可以在天然和变性条件下,使用Ni2+螯合基质进行纯化。由于这些基质具有亲水性和柔韧性,因而增加了靶蛋白的溶解度,并且几乎不会干扰蛋白质功能。这种独特的功能组合使组氨酸标签成为广泛的蛋白纯化应用的多功能工具。