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基于PiggyBac miR30的shRNA敲低载体
Vectorbuilder
Piggybac-mi
基于piggyBac miR30的shRNA敲低载体系统是一种简单有效的方法，用于稳定敲低哺乳动物细胞中靶基因的表达。这种基于转座子的系统利用质粒转染（而不是病毒转导）将由一个或多个基于miR30的shRNA（shRNAmiR）靶向目标基因和用户选择的ORF组成的多顺反子表达盒永久整合到宿主细胞基因组中。shRNAmiR转录本由内源性细胞微RNA途径处理以产生成熟的shRNA，从而促进靶基因mRNA的降解。与合成siRNA的瞬时敲低相比，piggyBac系统敲低的永久性具有几个主要优势（参见下面的优点部分）。
亮点
我们基于 piggyBac miR30 的 shRNA 敲低载体结合了用于敲低靶基因的优化微 RNA 系统。该载体与辅助质粒一起经过优化，可在大肠杆菌中实现高拷贝数复制，高效转染到各种靶细胞中，以及载体上携带的转基因的高水平表达。用户选择的启动子驱动包含用户选择的ORF和一个或多个具有优化的基于miR30的序列的shRNAmiR的多顺反子表达盒的表达，以介导有效的shRNA处理和靶基因敲低。
优势
启动子选择： 与利用RNA聚合酶III启动子（如U6）的标准shRNA系统不同，基于miR30的shRNA可以被不同的RNA聚合酶II启动子转录。这也使得使用组织特异性或诱导性启动子成为可能。
多个 shRNA 共表达： 由于RNA聚合酶II有效地转录长RNA，因此多个shRNAmiR可以表达为来自单个启动子的多顺子。因此，该载体可用于表达单个或多个shRNAmiR。
阅读ORF的共同表达： 用户选择的目的基因或报告基因ORF与shRNAmiR共表达，作为多顺子。这有助于直接监测shRNA转录。
永久集成和拆卸：传统转染导致DNA几乎完全瞬时递送到宿主细胞中，因为DNA会随着时间的推移而丢失。这个问题在快速分裂的细胞中尤为突出。相比之下，由于转座子整合到宿主基因组中，用piggyBac转座子质粒和辅助质粒转染哺乳动物细胞可以将转座子上携带的DNA序列永久递送到宿主细胞中。因此，使用该载体实现的靶基因敲低是稳定和永久的。对于许多实验目标来说，这可能是一个重要的优势。它允许对敲低表型进行长期分析。它有助于分离具有不同敲低水平和/或不同表型的克隆。当敲低载体携带荧光标记物（例如EGFP）时，它还允许具有不同转座子整合量的细胞（因此可能具有不同水平的敲低）通过具有不同荧光强度的流动分选细胞分离。
可逆性：如果携带piggyBac shRNA转座子的细胞再次用辅助质粒转染，则转座子可能会从某些细胞的基因组中切除，无足迹，从而消除这些细胞中shRNA的表达。但是，这将仅在细胞子集中发生。
技术简单：通过传统转染将质粒载体递送到细胞中在技术上很简单，并且比需要包装活病毒的基于病毒的载体容易得多。
安全： 传统转染没有通常与病毒载体相关的安全问题。
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