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如何做好NGS文库片段分布质控？
在NGS实验中，文库的质量直接决定了测序数据的产出效率和结果的可靠性，因此文库质控至关重要的一个步骤。NGS文库制备过程涉及DNA打断、接头连接、PCR扩增等多个步骤，每一个环节都可能引入偏差或错误。如果文库中混入接头二聚体、非目标片段，或者文库浓度被错误估计，轻则会影响数据量产出，导致有效数据不足、重复率升高，重则整批测序完全失败，造成样本和试剂的大量浪费。而这些指标，只有对文库片段分布进行质控后才能确定。
一、文库片段质控的目的
文库片段分布质控获得的关键信息有两个：
1. 确定片段大小：确认文库片段分布是否符合测序平台的要求，检测是否存在接头二聚体（通常<150 bp）、非特异性扩增产物等杂质。过短的非目标片段会更高效率的占据Flow cell表面的簇，浪费有效数据量；而片段过长则可能影响簇生成效率和测序质量。
2.上机浓度准确定量：准确测定文库浓度以确定上机时的混合比例和稀释倍数是必要的，但需要注意的是，上机定量应以mol浓度为准，并非Qubit测得的质量。之所以很多研究人员基于Qubit也能得到差不多的测序数据量，是因为文库的片段分布与预期一致。若文库片段分布出现波动，也会影响Qubit结果与mol浓度的换算。此外，同一批上机的文库如果片段分布差异过大，就更不能依赖Qubit结果上机，因为换算后mol浓度差异很大[1]。即使是qPCR定量，插入片段差异过大也会影响成簇效率，所以片段分布质控依旧是必要的。
二、不同质控方法有何区别？
实验室传统手工琼脂糖凝胶电泳能分析文库的片段分布，且成本低廉，但存在诸多问题：
l 操作烦琐耗时：制胶、点样、跑胶、拍照，每一步都需要手动完成
l 分辨率有限：难以区分片段大小相近的文库，无法精确判断片段分布
l 定量不准：只能通过亮度粗略估计，无法获得准确的浓度和摩尔浓度
l 结果主观：依靠肉眼判断，不同操作者之间结果差异大
l 难以标准化：批间差异大，数据可追溯性差
瑞孚迪LabChip GX Touch全自动核酸质控分析系统正是完美破解上述难题的NGS文库质控利器，其简化了繁琐的手工凝胶电泳步骤，在微流控通道里对DNA或RNA样品进行电泳分离和定性定量分析。LabChip GX Touch具备高灵敏度、适用样品范围广（包括弥散性DNA样本，游离DNA样本，small RNA样本等）、通量灵活、快速（每个样品耗时可低至30秒）等特点，提供更高重复性的、数字化的电泳数据，令样本及文库质控流程更趋简便、高效、精准。
三、样本及文库质控实例
1.基因组 DNA 完整性评估
LabChip GX Touch 成功检测了 75 个 FFPE 样本中抽提得到的基因组 DNA ，其检测结果生成的DNA 质量评分(GQS)值。重复测试及梯度稀释测试证实，在该 Assay 的定量线性范围内，样品检测结果及生成的 GQS 值有很好的重现性。
图1. 75 个样本的GQS评分值与对应人为划分的凝胶电泳降解评估值一致
该仪器的RNA质量评分（RQS）可准确且直观的评估RNA样品质量，同时提供多项具体质控指标：28S、18S、28S/18S（高度）、28S/18S（面积）、28S/总面积、18S/总面积、Fast Area Ratio，并可通过RQS阈值设定筛选高质量的样本。经验证，RQS 与安捷伦测定的RIN（RNA 完整性指数）密切相关并遵循相同的0-10量化评级，数值最高为10，代表RNA的完整性非常好；最低值为0，代表RNA的完整性很差。
2.文库质控
LabChip GX Touch 配套的 DNA High Sense 芯片对 75 个捕获后的低浓度文库样本进行库检的结果与使用 2100 的结果非常吻合。
下图为其中某一个文库的库检结果，包括 LabChip GX Touch 结果以及对应的 2100 图。
图2. LabChip GX 检测某一个文库样本的结果与对应 2100 结果对比图
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