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为什么做非天然氨基酸定点插入，大家都开始转向无细胞了？
近年来，无细胞蛋白合成已成为蛋白质制备的首选方法，因为它相比基于细菌和真核细胞的表达方法具有诸多优势，比如体外系统便于对反应进行修饰和优化，并且通过允许添加多种辅助物质能够合成难以表达的蛋白质，通过使用细胞内代谢反应的特定抑制剂，可以实现蛋白质的精确稳定同位素标记（这种标记在体内表达时不可避免地会被代谢）[1]。 而在蛋白质工程与新一代抗体偶联药物（ADC）的研发中，非天然氨基酸（nnAA/unAA）在蛋白特定位点实现高效、精准的插入，是拓展蛋白功能、实现定点偶联的关键技术。无细胞蛋白合成（CFPS）技术凭借其“开放体系”的天然优势，正在成为非天然氨基酸定点插入最有力的解决方案。 图1：通过CFPS掺入多种非天然氨基酸[2] 为什么非天然氨基酸插入如此重要？ 天然蛋白质由20种氨基酸构成，其侧链化学性质相对有限，难以满足多样化的功能改造需求。非天然氨基酸是天然氨基酸的衍生物，带有新型化学性质和多样结构的侧链基团，可在蛋白特定位点引入叠氮、炔基、卤素、酮基等“化学手柄”，从而实现： ADC 定点偶联：为抗体提供特异性偶联位点，显著提升药物均一性，改善药代动力学（PK）特性，实现毒素精准递送； 蛋白质工程与酶进化：增强催化活性、热稳定性或光稳定性，赋予荧光标记等探测功能； 生物材料与基础研究：制备新型蛋白材料，研究蛋白质相互作用及翻译后修饰对功能的影响。 据文献报道，已有超过100种非天然氨基酸被位点特异性地插入蛋白质，用于荧光探针、聚合物及药物偶联等多种目的[2]。 图2：氨基酸结构 活细胞体系存在的瓶颈 既然非天然氨基酸这么好，为什么长期以来难以大规模应用？ 传统的基于活细胞的表达体系在非天然氨基酸插入中存在固有局限： 细胞膜屏障导致许多非天然氨基酸胞内摄取效率低下； 部分非天然氨基酸及正交表达元件对宿主细胞存在毒性，限制了表达产量； 胞内代谢网络可能降解或修饰非天然氨基酸底物； 释放因子 1（RF-1）对 UAG 密码子的识别与正交tRNA（o-tRNA） 形成直接竞争，导致插入效率不足。这些瓶颈推动了CFPS体系在该领域的快速发展。 CFPS 体系的技术优势 CFPS 体系通过在体外重建转录 - 翻译偶联反应，其开放性天然具备优势：首先，非天然氨基酸可直接添加至反应体系，无需考虑跨膜运输，浓度可精确控制。其次，由于没有活细胞的生长压力，CFPS不受非天然氨基酸或目标蛋白毒性的影。另外，CFPS反应体系开放，研究人员可自由优化氨酰tRNA合成酶（aaRS）/tRNA的比例，添加辅助因子。最后，相比活细胞，CFPS在多位点同时插入非天然氨基酸的效率显著更高。 目前已有研究证明CFPS体系在非天然氨基酸插入上的应用，日本理化学研究所（RIKEN）的Jiro Adachi等人基于抽提物，实现了超过90%的UAG翻译效率，并可在蛋白的多个位点插入不同非天然氨基酸[2]。 图3：基于 RFzero-iy 的无细胞系统用于非天然氨基酸掺入[2] 斯坦福大学Swartz实验室开发的正交tRNA与目标蛋白在CFPS体系中共转录翻译的方法，抑制效率达50%—88%，改造蛋白产量可达0.9—1.7 mg/mL[3]。 图4：CFPS平台用于定点插入非天然氨基酸的示意图[3] 此外，开放的无细胞体系还天然适合作为aaRS突变体的高通量筛选平台，Sutro公司利用这一优势，直接在无细胞体系中筛选出对pAMF具有高活性和高特异性的新型TyrRS突变体。 图5：pAMF特异性TyrRS变体可产生具有高DAR值的强效ADCs[4] 产业案例 珀罗汀生物是国内在这一方向上具备扎实技术积累的团队。公司依托自研的CFPS平台，建立了成熟的非天然氨基酸定点插入技术路线：通过终止密码子（UAG）扩展，搭配RS/tRNA系统，并在体系层面优化释放因子（RF）竞争，实现非天然氨基酸的高效、准确插入。 在实际验证中，公司平台已完成pAzF、pAcF等多种常用非天然氨基酸的插入测试，并在绿色荧光蛋白（GFP）等模型蛋白上验证了从单点到多位点插入的表达效率。 图6：多位点插入效率测试 更具挑战性的是，公司成功实现了某毒性蛋白在6个位点同时插入非天然氨基酸，质谱检测结果进一步表明，交付蛋白中“非正确插入”的非天然氨基酸占比极少，插入特异性优异。而这类任务在活细胞体系中几乎不可能完成。这一结果对依赖非天然氨基酸定点插入的毒性蛋白及ADC等创新药物研发具有重要参考价值。 图7：验证结果。左图为蛋白表达胶图，右图为质谱检测峰图 结语 从RFzero快速菌株构建，到协同转录o-tRNA平台，再到产业化实践，CFPS正在重塑非天然氨基酸定点插入的技术格局。对研发团队而言，选择一套成熟、开放、可灵活调控的无细胞天然氨基酸插入平台，无疑将加速从“概念验证”到“临床候选物”的转化进程 参考文献： Terada T., Kusano S., Matsuda T., Shirouzu M., Yokoyama S. Cell-Free Protein Production for Structural Biology. Adv. Methods Struct. Biol. 2016:83–102. doi: 10.1007/978-4-431-56030-2. Adachi J, Katsura K, Seki E, et al. Cell-Free Protein Synthesis Using S30 Extracts from Escherichia coli RFzero Strains for Efficient Incorporation of Non-Natural Amino Acids into Proteins. Int J Mol Sci. 2019;20(3):492. Published 2019 Jan 24. doi:10.3390/ijms20030492. Albayrak C, Swartz JR. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 2013;41(11):5949-5963. doi:10.1093/nar/gkt226. Zimmerman ES, Heibeck TH, Gill A, et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjug Chem. 2014;25(2):351-361. doi:10.1021/bc400490z.
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