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【实操经验篇】鼠源脂肪间充质干细胞的分离培养

2022-05-05

 

 

脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞,与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪组织均可用于分离ADSCs,其中鼠脂肪组织通常取自腹股沟处脂肪垫。听说你们都想偷师ADSCs原代取材,那就来安排!

⭐ 材料准备
✔ OriCell®大鼠脂肪间充质干细胞完全培养基(货号:RAXMD-90011)
✔ OriCell®胰蛋白酶细胞消化液(0.25%)(货号:TEDTA-10001)
✔ 0.1% I型胶原酶溶液

⭐ 实验步骤
1、10天龄到4周龄大鼠1只,麻醉处死,75%乙醇浸泡消毒3~5min。无菌条件下切开腹股沟皮肤,暴露腹股沟脂肪垫。
2、钝性剥离脂肪组织,清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎,转移至15mL离心管中。
3、加入3~4倍体积的0.1% I型胶原酶溶液,37℃水浴振荡约20min,直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织,辅助消化。
4、250×g,4℃,离心5min。注意离心机预冷至4℃。
5、小心吸去上层油脂,注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL完全培养基,重悬沉淀,转移到新的离心管中,再次离心5min。
6、重复洗涤一次,吸去上清。
7、加入8mL完全培养基重悬沉淀,转移至T25培养瓶中,置于37℃,5% CO2温箱中。
8、待细胞贴壁生长48h后首次观察、换液。
9、换液时通过弃去培养基,从而去除未贴壁的细胞。
10、以后每两天更换一次培养基,细胞汇合达80%-90%时,0.25%胰蛋白酶消化,按1:2或1:3比例首次传代。

⭐ 注意事项
✔ 取材时应将组织清洗干净,仔细剥离去除血管和筋膜组织;
✔ 脂肪组织在剪碎的过程中不能研磨,以免破坏细胞;
✔ 消化完后的组织在离心前把离心机预冷,使细胞更好的与油脂分离;
✔ 用明胶或者胶原蛋白处理培养皿底壁,有利于细胞的贴壁生长。

⭐ 鉴定
1、形态学观察:原代培养后,传代2-3次,ADSCs呈现单层,梭状或多枝状的细胞形态,其直径在25-30 um,待细胞达到汇合时,它们形态上呈纺锤形,类似于成纤维细胞,贴壁较牢固。

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2、微生物:常使用培养法和PCR法检测细菌、真菌、支原体。
3、增殖:CCK8生长曲线,计算倍增时间。
4、标记物检测:一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性(>70%);CD34、CD45、CD11b为阴性(<5%)。
5、诱导分化实验:在特定的诱导条件下,脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。