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工艺加油站|mRNA纯化新方法:POROS Oligo dT(25)亲和层析填料

2022-04-26


mRNA 疫苗属于核酸疫苗,是在第一代减毒活疫苗或灭活疫苗和第二代亚单位疫苗基础上发展起来的第三代疫苗,它是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接导入到宿主细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。

早在1990 年Wolff 等就首次展示mRNA 的治疗潜力,和传统疫苗相比,其生产简单、迅速,在数周之内即可获得临床规模的mRNA产品,近年来发展迅速,虽然目前没有获批上市的产品,但很多已处于临床期,简单列举如下。

表1 目前临床阶段的RNA疫苗略举

从结构上来看,mRNA疫苗可分为两大类:非复制型mRNA(non-replicating mRNA)和自扩增性mRNA(self-amplifying mRNA)。

无论是哪一种,都具有5‘和3’端的非翻译区(untranslated regions,UTRs),开放阅读框和一个3’端的poly(A)尾巴。

非复制型mRNA一旦进入细胞并从核内体释放到细胞质中,mRNA 立即被翻译;自扩增mRNA 通常来源于正链RNA 病毒的基因组,它既编码目的抗原,又编码细胞内RNA 扩增和高水平抗原表达所需的病毒非结构蛋白。自扩增mRNA 可直接自扩增产生RNA 中间体和多个抗原编码亚基因组,产生高水平的编码抗原。

从生产工艺角度来看,mRNA疫苗的关键质量属性包括:

  • 5’加帽的效率和结构,Cap的结构和mRNA的稳定性密切相关,并影响着mRNA的翻译效率;

  • UTR的结构和长度,这是影响mRNA翻译效率的主要的因素;

  • 编码区的序列;

  • poly-A尾巴的长度,大多数的mRNA的降解是从Poly(A)尾巴开始,这一结构对稳定mRNA结构具有极其重要的作用;

  • mRNA的纯度。

这些都会影响mRNA胞内目的基因的表达。

图1 mRNA疫苗的关键质量属性

目前业内常用的mRNA纯化方法包括反相、离子交换和分子筛等,反向色谱是使用最为广泛的方法,常常需要加入离子对,但该方法的载量较低,并需要使用易燃、有毒有害的溶剂。而离子交换层析和分子筛广泛应用却受限于较差的选择性和较低的载量。

赛默飞最新推出的POROS™ Oligo (dT)25 亲和填料,专门应用于mRNA的纯化。该填料为PS-DVB硬胶基质,平均粒径为50微米,基质表面通过linker键合25个dT配基,通过亲和结合mRNA的poly A尾巴进行纯化,大大简化了mRNA的捕获过程。该填料耐受高盐、高pH和高温,使用简单,不需使用任何易燃、有毒的试剂。

图2 POROS Oligo dT(25)亲和mRNA示意图

POROS™Oligo(dT)25的特性

  • 特异性结合mRNA Poly(A)尾,易于从粗转录混合物中纯化mRNA,以有效去除质粒DNA和其他成分

  • 简化工艺流程,有助于最大程度地提高纯化效率,降低后续精纯步骤的复杂性

  • 出色的放大性

  • 无动物源


REFERENCES

1. Nicholas A. C. Jackson1 etc,The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective[J], npj Vaccines

2. 胡瞬, 易有金, 胡涛, 等. mRNA 疫苗的开发及临床研究进展[J]. 中国生物工程杂

3. 张琳,李燕,安志杰,新型冠状病毒mRNA 疫苗研发进展[J],中国疫苗和免疫


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