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mRNA疫苗现状、前景及挑战

2022-11-24

▉ 摘要

疫苗是医学领域最伟大的进步之一,也是一种重要的疾病防治手段,在传染病防控中发挥着重要作用。自1798年天花疫苗和1885年狂犬病疫苗以来,疫苗技术从使用灭活及减毒病原体发展到使用仅包含可触发免疫反应的病原体成分的亚单位。常用的疫苗包括类病毒颗粒疫苗、重组病毒载体疫苗以及类毒素疫苗、多糖疫苗或蛋白疫苗。


图1 疫苗发展里程碑


传统的减毒和灭活疫苗至今仍被广泛使用(如卡介苗和脊髓灰质炎灭活疫苗等)。然而,由于使用全部病原体,它们存在较大的安全性风险,通常它们没有明确的成分。就类毒素疫苗和亚单位疫苗而言,尽管它们具有较好的安全性和稳定性,但需要使用佐剂才能产生强烈的免疫反应,并且保护时间有限(表1)。因为没有标准化的生产工艺,传统上的疫苗研发通常是一个漫长、有挑战性大且昂贵的过程。此外,SARS和埃博拉疫情以及新冠大流行表明,传统的技术平台并不适合快速、高效应对突发公共安全事件。病毒载体和DNA技术是两个前沿技术平台,具有开发快和生产工艺灵活性的特点。然而,病毒载体疫苗的生产成本高昂、成分复杂、保护率偏低且具有潜在的安全性风险,DNA疫苗的免疫原性差且存在基因整合安全性风险(表1),限制了其在临床中的广泛应用。


表1 各类疫苗的优点(+)和缺点(×)


mRNA一些独特的技术优势,使其非常有希望成为传统疫苗甚至DNA疫苗的替代品。与减毒或灭活疫苗不同,mRNA只表达特定抗原并定向诱导免疫反应。此外,它促进体液和细胞免疫反应,并诱导先天免疫系统。与DNA疫苗相比,mRNA更安全有效,因为表达不需要进入细胞核,随机基因组整合的概率几乎为零;此外,mRNA在细胞中会在较短时间内(2-3天)降解。mRNA疫苗编码不同抗原不会影响mRNA主体结构的理化学性质,有利于采用标准化生产。由于mRNA生产是基于体外无细胞转录反应系统,因此无其他疫苗生产中常见的细胞来源杂质和病毒污染物等安全性风险。另外,mRNA疫苗开发周期短且具有广谱性,自2020年1月中国科学家公布新冠病毒基因序列,到12月FDA批准BioNTech的BNT162b2的紧急使用权,仅仅间隔不到1年的时间。目前,mRNA疫苗正被研发用于多种传染性疾病,例如HIV、狂犬病毒、流感、埃博拉、疟原虫和呼吸道合包病毒(RSV)等。


▉mRNA疫苗结构及工程化修饰

mRNA疫苗的结构类似于真核mRNA,一个单链分子在5“端有一个帽子结构(Cap),在3“端有一个Poly(A)尾,一个开放阅读框(ORF)两侧有一个非翻译区(UTR)。

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图2 mRNA疫苗结构


5“Cap是mRNA疫苗非常重要的结构,它与真核生物翻译起始因子(eIF4E)结合来启动翻译,另外5“Cap使其免于核酸外切酶的降解,还可促使mRNA环化形成空间及结构,增强稳定性。甲基化程度不同可形成3种类型的帽子:CAP 0型、Cap 1型和Cap 2型。3’UTR尾部是一段Poly A序列,与帽子结构类似,Poly(A)尾也能起到保护mRNA防止被核酸外切酶降解的作用,Poly A也参与到翻译及其调控过程中,可与多聚腺苷酸结合蛋白(PABP)结合形成环状复合物,参与翻译的起始过程。非翻译区(UTR)影响转录调控和mRNA稳定性,这些区域强烈影响翻译效率。调节先天免疫反应的策略,如引入非天然核苷(NTPs),以及通过密码子优化提高翻译效率,也常用于mRNA疫苗。辉瑞/BioNTech的mRNA疫苗BNT162b2和Moderna的mRNA-1273利用了核苷修饰技术,用假尿苷替换尿苷。而CureVac的mRNA疫苗CVnCoV使用未经修饰的天然mRNA,通过其RNActive 平台改变mRNA序列并优化密码子,以提高mRNA的稳定性和免疫原性。


5“Cap、Poly A尾巴及编码序列两侧的5ʹ和3ʹUTR元件深刻影响mRNA的稳定性和翻译,这些都是疫苗的关键问题。通过工程化改造mRNA疫苗可大大增加其稳定性及免疫效力。

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图3 疫苗工程化修饰改造


▉mRNA生产及展望

与传统疫苗相比,mRNA最重要的优势之一是其相对简单的制造。mRNA疫苗生产可分为上游加工(包括酶促反应生成初级mRNA)和下游加工(包括纯化mRNA)(图4)。

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图4 mRNA生产工艺


▉上游工艺

转录:上游主要是以质粒为模板在T7、SP6或T3 RNA聚合酶的作用下转录成初级mRNA,该反应只需要几个小时,通常,每毫升反应可获得毫克级的初始mRNA。


加帽:初始mRNA加帽,可以在转录反应期间通过使用Cap类似物替代三磷酸鸟苷(GTP)底物来实现。或者,可以使用牛痘加帽酶(VCC)和甲基供体作为底物在第二次酶反应来加帽(图4)。相比使用Cap类似物加帽(60–80%),尽管第二种方法的加帽效率更高(可达100%),但使用cap类似物加帽工艺更快,不需要二步酶促反应。然而,由于价格的原因,Cap类似物可能会对生产成本产生影响,特别是在大规模制造的情况下考虑。


▉下游工艺

上游产生的mRNA需通过多个纯化步骤从反应混合物中分离和纯化,以达到临床质量要求(图4)。反应混合物不仅包含所需mRNA,还包含许多杂质,如酶、残余NTP和DNA模板,以及转录期间形成的异常mRNA(如ds mRNA)。


色谱是制药行业广泛使用的一种纯化方法,离子交换色谱法(IEC)可用于大规模纯化mRNA,弱阴离子交换色谱法已成功用于mRNA的纯化。然而,这种色谱必须在变性条件下进行,使得该工艺需严格控制温度。


Olig dT亲和色谱可与mRNA中存在的poly-A尾部结合,常用于捕获mRNA并获得高纯度产品,且可规模化纯化生产,但存在结合能力低和低成效的缺点。


切向流过滤(TFF)浓缩可以去除小分子杂质,这依赖于DNA酶消化去除质粒模板,质粒模板去除也可以通过羟基磷灰石法或疏水色谱法(HIC)实现。


▉未来方向

目前生产工艺(如体外转录工艺)难以满足未来大规模商业化需求,连续流生产模式是未来的发展方向,具有低成本的独特优势。连续流生产模式已经在化学和制药行业中使用,具有灵活且经济高效的特点。此外,连续流生产模式实现工艺的集成化还可以缩短生产时间,促进自动化和过程分析技术(PAT),从而提高生产率和产品质量。mRNA制造工艺的相对简单性使得该过程非常适合于连续流生产模式,尤其是在微流控模式下(图5)。在这种规模下,在特定条件下可以加快反应速度,可以最大限度地降低昂贵试剂(如牛痘加帽酶、甲基转移酶等)的成本。此外,即时基质进料和产品收获策略可以在流程中实施,以促进过程控制、再循环和物料的再利用。

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图5 mRNA连续流生产模式


▉mRNA商业化生产挑战

在mRNA生产过程中作为起始模板使用的质粒产能及质量的非常关键因素,也是制约mRNA疫苗生产的瓶颈。mRNA生产需要以质粒DNA为模板转录成初始mRNA,环状质粒需酶切线性化,线性化效率对工艺生产有较大影响;另外,质粒模板中的Olig dT的长度决定mRNA疫苗Poly A的长度,Poly A长度影响mRNA的稳定性及翻译效率,因而影响mRNA疫苗的有效性。另外,mRNA疫苗需要控制Poly A长度及体外翻译效率在一定范围,Poly A长度的分析方法及体外翻译效率检测方法也是mRNA疫苗质量研究的难点,非常具有挑战性。Poly A长度及外翻译效率取决于质粒模板中的Olig dT的长度,质粒模板中的Olig dT常随大肠杆菌传代而丢失,因此在源头上控制质粒模板的质量对mRNA疫苗的效果非常重要。


质粒作为mRNA生产的关键原材料,需要在良好生产规范(cGMP)条件下,且需要有稳健的工艺,在临床试验审批(Investigational New Drug,简称IND)申报时需要提供药学研究资料,包括主细胞库和工作细胞库、质粒DNA生产工艺等,在制备用于产生质粒DNA的工程菌库时,也需遵循cGMP实践的原则并参照指南进行相应的检测。


来源:医药速览

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参考出处:

[1]. Plotkin SA, Plotkin SL. The development of vaccines: how the past led to the future. Nat Rev Microbiol 2011;9(12):889–93.

[2]. Rappuoli R. Timeline: Vaccines. Cell 2020;183:552.

[3]. Drury G, Jolliffe S, Mukhopadhyay TK. Process mapping of vaccines: Understanding the limitations in current response to emerging epidemic threats. Vaccine 2019;37(17):2415–21.

[4]. Mao HH, Chao S. Advances in Vaccines. Curr Appl Pharm Biotechnol 2020:155–88

[5]. Rauch S, Jasny E, Schmidt KE, Petsch B. New Vaccine Technologies to Combat Outbreak Situations. Front Immunol 2018;9.

[6]. Pollard C, De Koker S, Saelens X, Vanham G, Grooten J. Challenges and advances towards the rational design of mRNA vaccines. Trends Mol Med 2013;19(12):705–13.

[7]. Maruggi G, Zhang C, Li J, Ulmer JB, Yu D. mRNA as a Transformative Technology for Vaccine Development to Control Infectious Diseases. Mol Ther 2019;27(4):757–72.

[8]. Sullenger BA, Nair S. From the RNA world to the clinic. Science 2016;352 (6292):1417–20.

[9]. Steinle H, Behring A, Schlensak C, Wendel HP, Avci-Adali M. Concise review: application of in vitro transcribed messenger RNA for cellular engineering and reprogramming: progress and challenges. Stem Cells 2017;35(1):68–79.