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一文解锁酶消化法,轻松搞定组织获取原代细胞分离

2024-05-14

一, 酶功能及适用范围介绍

细胞作为生物的基本结构单元(病毒除外),在生命活动过程中扮演着重要角色,在生物医药领域经常被用于基因和药物研究的工具。实验使用到的细胞主要是细胞系(Cell line)和原代细胞(Primary cells),这两种细胞各有优缺点,例如原代细胞能够很好地模拟生物体内的环境但是重复性差;细胞系虽然重复性好,但是不能很好地模拟生物体内的环境。因此,很多时候在实验会需要进行原代细胞的分离,对于原代细胞的分离主要是酶消化法,参与消化的酶因组织差异而存在不同,下边就介绍一下实验室常用的用于分离原代细胞的酶。

(图1 原代细胞与细胞系的比较)

胰蛋白酶(Tyrisin)是目前各细胞实验使用最广泛的细胞/组织消化试剂,工作浓度在0.25%胰酶(外加0.02%EDTA(0.53mM)),它适用于消化细胞间质较少的软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等组织原代细胞的分离以及实验室的细胞传代。它的作用机制是作用于精氨酸或赖氨酸相连接的肽腱,消除细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使组织分散成单个细胞而分离获得原代细胞(Primary cells)。

乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)是,一种金属螯合剂,用于螯合培养基或平衡液中的二价离子,有助于增强胰蛋白酶的水解功能;此外血清能够降低胰酶活性,因此在终止消化的时候可以添加至少5%的血清去终止胰酶的消化。

二, 胰蛋白酶配制

胰蛋白酶(Tyrisin)是为一种蛋白酶,在细胞培养实验和原代细胞分离过程很常见,尤其是细胞传代或冻存消化过程最常见的酶,在此以0.25%胰酶配制举例:

(1)称取胰酶:电子天平称取0.25g胰蛋白酶(Tyrisin),然后溶于100ml 无菌PBS;(2)低温低速搅拌:在胰蛋白酶加入到PBS中后,需要低温长时间搅拌(4℃/冰浴,过夜-12-16h);(3)调节pH:胰酶的最佳消化pH在7.4左右,因此需要调整pH;(4)过滤分装:一般使用0.22μm滤器进行过滤,这样几乎就消除了细菌,可以多过滤1-2次,尤其在大批量制备时候;(5)分装保存:根据实验室的使用情况进行分装,然后冻存在-20℃,正在使用的少量胰蛋白消化液于4℃保存即可;

(备注:低速配制,高速会导致胰蛋白酶气泡进而酶的效力大大折扣,如果要加强消化能力,可以添加终浓度为0.02% EDTA(0.53mM)主要是消除PBS中Ca2+的影响,增强酶活性。)

三,原代细胞的分离(以小鼠肾脏为例)

对于原代细胞的分离成功与否最关键因素有三:(1)全程无菌操作;(2)选择合适的酶和浓度;(3)选择合适的消化时间。现在以小鼠肾脏为例,进行原代细胞分离的剖析:

(a)准备工作

对于原代细胞分离培养通用的准备工作主要涉及培养基(普通培养基,可以适当添加细胞因子Egf和/或bFGF)、无菌操作环境(紫外灯15-30 min)、实验器材高压灭菌、实验动物。


(图2 小鼠肾脏原代细胞分离示意图)

(b)细胞分离步骤

(1)小鼠安乐死/牺牲:大家要慢慢养成尊重动物福利的习惯,不然后期各方面不好说,尤其是面向世界各地研究员;

(2)暴露小鼠腹腔:使用镊子夹住小鼠(3周左右)腹部表面皮肤,在腹部中间横向开口约0.5cm,然后让皮肤直接往上扯(有点残忍,但是显著性减少细菌感染);当然有可以把腹部皮肤逐步用镊子扯开,然后露出完整腹膜(千万别弄破);

(3)取出肾脏器官:使用无菌剪刀将腹膜纵向剪开,然后在小鼠腰部找到肾脏组织,使用镊子将其取出;

(4)组织杀菌:将肾脏组织转移至约10mlPBS(含3x or 2x 青霉素-链霉素)中反复颠倒消毒3-5 min;

(5)组织破碎:根据组织块的大小(一般建议不超过1cm3),转移直尖底1.5ml EP管中,加入适量消化液(总体积不超ep管2/3),然后使用眼科钳充分剪碎组织;

(6)胰酶消化:使用终浓度为1-2 mg/ml胶原酶 Ⅰ在37℃震荡水浴摇床消化20-30min,可以在消化10min、15min、20min、25min、30min取出少量消化液查看消化液中单个细胞的情况(是否存在皱缩/组织块),进而确定最佳消化时间。

(7)过滤:体细胞直径一般在10-20μm之间,但组织原代酶消化时候,不能用稍大一些的滤器,而是要大得多的滤器(能过滤掉组织就行),一般选择200-400目(数值越大,滤网直接越小);

(8)离心收集细胞:在1000rpm左右离心5min获得的过滤细胞悬液,并使用4℃预冷的培养基/PBS洗涤细胞3-5次;

(9)细胞种植:根据细胞计算,按照不同尺寸的细胞培养皿种植细胞,一般在培养皿的80-90%融合率即可,因此此时刚分离非细胞,可能细胞的分离有利于细胞生长,但是浓度太高则会因为分离过程存在死亡细胞,会释放大量的损伤相关分子模式(DAMP)损伤正常细胞;

(10)细胞观察与换液:一般在种植24h左右换液并观察细胞,在36-48h根据细胞的密度和细胞状态两个因素,确定继续培养还是传代或者后续实验。