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干货分享 如何选择合适的细胞杀伤功能评价实验？
2024年2月16日，全球首款TIL细胞药物获得FDA批准上市，这是基因和细胞治疗领域的重大突破，也是肿瘤免疫治疗领域的众望所归！
近年来，免疫细胞疗法作为一种新兴的治疗手段，在肿瘤治疗领域展现出了巨大的潜力。通过向肿瘤患者输入具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发集体抗肿瘤免疫反应，从而达到治疗肿瘤的目的。截至2023年6月，全球生物制药行业中有1989种细胞治疗类管线处于临床前或临床阶段[1]，其中，免疫细胞的杀伤活性是评价免疫细胞疗法治疗效果的一个重要因素。
小分子药和ADC药物在体外评价对肿瘤细胞的杀伤作用时，通常采用经典的基于ATP的方法来检测肿瘤细胞的活力 (逐典货号CY074F0100KIT)，ATP作为细胞新陈代谢的一个重要指标，在一定范围内与活细胞数目呈良好的线性关系，是细胞活力检测的重要标志性分子。免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价一般会涉及免疫细胞和肿瘤细胞两种细胞，因此不能采取基于ATP的检测手段，常用的方法有荧光素酶报告基因检测、放射性同位素51Cr释放检测、LDH活性光吸收检测和EuTDA细胞毒法，下面我们来盘点这四种检测方法的优劣势，以供大家进行选择。
将荧光素酶报告基因导入靶细胞，活的靶细胞会表达荧光素酶，加入荧光素酶报告基因检测试剂 (逐典货号CY058F0100KIT) 后释放出光信号，活的靶细胞数量与释放出的光信号成正比，从而可以评判免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
优势：
① 灵敏度高, 背景值低。
② 同时测定对多种靶细胞的杀伤作用。用不同报告基因转染的细胞系可同时测定杀伤效应, 结果互不干扰。
③ 机制研究。用不同的基因调控元件控制报告基因的表达，可进一步研究作用机制。
不足：
周期相对较长。建立报告基因稳定转染细胞系实验周期较长。
图1. 萤火虫荧光素酶发光原理
用放射性51Cr标记靶细胞，在效应细胞杀伤靶细胞的过程中，靶细胞由于细胞膜失去完整性，向培养基中释放51Cr，培养基中的51Cr与被杀死的靶细胞数量成正比，从而评估免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[2]。
优势：
测量细胞介导的细胞毒性的金标准。
不足：
① 51Cr放射性对研究者的健康状况有一定的影响。
② 对昂贵设备和专业人员的需求能力没有得到相对普及。
图2. 51Cr释放测定原理。该过程分为3个主要步骤：51Cr标记靶细胞，通过细胞裂解释放51Cr以及检测释放的51Cr
正常情况下，乳酸脱氢酶 (LDH) 存在于活细胞胞浆内，不能透过细胞膜，当细胞受到损伤时，LDH可以透过细胞膜释放到培养基中。释放出来的LDH和被杀伤的靶细胞成正比，利用酶标仪读取OD值，即可评估杀伤细胞的活性。
优势：
① 方法简单，可测的通量比较高。
② 成本相对比较低。
不足：
① 如果效应细胞状态不好，会出现数据重复性不好、结果不稳定的情况。效应细胞状态与个体间的差异及冻存复苏等均有关。
② LDH可能存在部分自发释放现象，导致出现假阳性结果。
EuTDA的检测原理与51Cr测定法相似，乙酰酯化的BATDA能迅速进入靶细胞，并在水解作用下形成TDA留在靶细胞内，在细胞受到损伤后释放到胞外的TDA与荧光探针Eu3+ 形成Eu-TDA 复合物，通过检测Eu-TDA 的时间分辨荧光信号，来评价免疫细胞对肿瘤细胞的特异杀伤活性。
优势：
灵敏度高、安全性好，对于非特异性死亡的干扰较小。
逐典生物萤光素酶报告基因检测试剂盒旨在准确、灵敏、高效地测定萤火虫萤光素酶活性，针对报告基因检测不同的侧重需求，逐典推出了3种检测系统。
产品特点：
1.检测灵敏度高，信号稳定性好
HEK293-NFκB-LUC细胞加入梯度稀释的TNFα 在37°C、5% CO2条件下刺激6小时后，分别用增强型、超敏型、稳定型检测试剂进行信号检测。
2.操作方便
仅需将底物和萤光素酶检测缓冲液混合后直接加入到细胞即可。
3.稳定性好
同时在10次反复冻融实验中，逐典全系列报告基因检测试剂盒显示出较强的稳定性。
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参考文献
【1】http://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.001
【2】Kiesgen S, Messinger JC, Chintala NK, et al. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 2021 Mar;16(3):1331-1342. doi: 10.1038/s41596-020-00467-0.
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