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分子胶药物的发现与挑战
作者:WuXi AppTec 文章来源:药明康德赋能前沿
分子胶(Molecular Glue)是一类小分子化合物,它能够通过改变目标蛋白质的表面特性以促进或诱导其与其他蛋白的蛋白-蛋白相互作用(Protein-Protein interaction,PPI)。通过诱导PPI的产生,分子胶可以实现特定的生物学功能,如蛋白降解、通路抑制或激活。作为一种具有创新性的药物候选化合物,它具有较高的靶向性和生物利用度,且能够在特定的环境条件下控制药物的释放。因此,分子胶凭借其独特的特性在糖尿病、心血管疾病、眼科疾病以及癌症的治疗上展现出广阔的应用前景。
1. 分子胶药物与靶向蛋白降解
大多数疾病的发生都与蛋白或者信号通路的激活或抑制有关,而在这些过程中均涉及到大量的蛋白-蛋白相互作用。因此,人为地操控PPI成为了调控蛋白生物学功能、治疗相关疾病的新型策略。
目前,分子胶药物最广泛的应用是诱导蛋白的降解: 通过改变靶蛋白或者E3连接酶的表面,诱导PPI,进而形成“靶蛋白-分子胶-E3连接酶”的三元复合物,并诱导靶蛋白的多聚泛素化,最终使靶蛋白通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。在已成功上市的分子胶药物中,沙利度胺,来那度胺等免疫调节药物均是通过诱导靶蛋白降解达到治疗效果[1]。近些年来,更是有大量药企加码靶向蛋白降解(Target protein degradation, TPD)的分子胶药物研发 (图1)。
图1. 分子胶研发历史及代表性药物[1]
目前市场之所以关注靶向蛋白降解的治疗策略,并选择分子胶作为降解剂,一方面是由于TPD药物的特殊机制,使其相比传统小分子药物能够靶向更广泛的蛋白,包括一些难以成药的支架蛋白、毒性蛋白等。另一方面,分子胶在众多TPD技术中有着独一无二的优势。与PROTAC进行对比,分子胶具有更好的理化性质、无Hook效应、对亲和力的要求也相对较低等优势(图2),这些优点均为分子胶的药物提供了极大的临床潜力。但是不能忽视的是,相比之下,PROTAC类的靶向嵌合体更容易进行理性设计,而分子胶药物的发现则较为困难。
图2. 分子胶与PROTAC的对比[2]
2 分子胶药物的发现
目前分子胶药物的发现方式可以概括为三种:偶然发现、筛选或信息学和理性设计(药化修饰)[3,4,5]。虽然已有不少较为积极的例子,但是分子胶的发现依然面临许多挑战。由于需要诱导蛋白与蛋白的相互作用,该过程往往涉及蛋白的构象变化,这使得分子胶药物的早期发现通常具有较低的命中率,同时也使得分子胶的结构-活性关系(Structure-Activity Relationship,SAR)分析,或者进行基于结构的药化设计变得更加困难。此外,化合物对化学修饰的敏感度也非常高。面对这一系列的挑战,目前主流的策略是通过较大规模的筛选来实现苗头化合物的发现。
综合分子胶发现的多种策略,药明康德生物学业务平台早期研发团队搭建了一套分子胶发现平台,以赋能分子胶药物的发现。该平台主要包括DNA编码化合物库筛选(DNA Encoded Library Screening,DEL )、亲和质谱筛选(Affinity Screen Mass Spectrometry,ASMS)和高通量筛选(High Throughput Screen,HTS)三种不同的方法(图3)。
图3. 药明康德生物学业务平台—分子胶筛选平台
2.1 DEL筛选
DNA编码化合物库是基于组合化学构建的小分子化合物库,每种化合物有着独一无二的DNA编码进行标记。DEL库拥有超大的化合物多样性,极低的单个分子合成成本,并且能够提供丰富的SAR信息。DEL库的一般采取亲和力筛选,因此非常适用于分子胶的发现(图4)。
图4. DEL筛选能力平台赋能分子胶发现
针对分子胶药物发现,药明康德生物学业务平台早期研发团队可以提供两类不同类型的DEL库:一种是多样性化合物库,该系列化合物库拥有超过200个不同合成路线的子库,包含超过50亿种不同结构的化合物。在设计和合成这些化合物的过程中,建库团队通过总结和整理已经上市或在研的化合物,提炼了超过6000个不同的生物活性结构,用于库的构建。这种高度多样性的库提供了新颖的结构和广阔的化学空间,适用于针对一些尚无分子胶或小分子配体报道的靶点筛选。
另一种是分子胶Focus库,这类化合物库根据已报道的小分子配体或分子胶的核心骨架进行设计,在设计过程中进行基于逆合成分析的结构功能性拆分,使用大量的化学修饰,极大地扩展核心骨架的化学空间。这类库的特点是具有很强的靶点针对性,成功率也会更高。目前,药明康德早期研发平台已经设计并合成了E3连接酶Cereblon (CRBN)的分子胶Focus库。CRBN分子胶的溶剂暴露区是诱导PPI和产生选择性的关键结构,针对这部分结构,库设计团队采用多样性的合成砌块进行修饰,通过多条合成路线,平行开发了in-solution DEL和固载在Beads上的on-bead DEL,最终得到了拥有约六百万种化合物的Focus库。对于已有分子胶或者小分子配体报道的靶点,选择这类库可以有效提高筛选的数据表现和成功率(图5)。
图5. 药明康德生物学业务平台的分子胶DEL库
在对分子胶DEL库进行筛选时,根据DEL库的不同形式(in-solution或on-bead)会采用不同的方法。针对in-solution DEL,主要采用“Single pull-down & Single Reaction”的方式进行亲和力筛选,通过对比单一蛋白孵育和双蛋白孵育条件的富集度的比值(Enrichment fold change)来寻找能诱导并形成三元复合物的分子胶苗头化合物。这个过程中,更高的Enrichment fold change会表明该化合物的富集更依赖于两个蛋白的同时存在(图6)。
图6. In-solution DEL的Single Pull-down & Single Reaction筛选方法
药明康德分子胶筛选平台首先使用已报道的GSPT1/CRBN分子胶CC-885作为工具分子和上文提到的多样性DEL库一同进行筛选。我们将CC-885连接上DNA后混入多样性DEL化合物库中。结果表明,CC-885的on-DNA 工具分子在GSPT1和CRBN蛋白同时孵育的条件中,富集度远高于单一蛋白孵育的条件。同时,在该筛选后我们也发现了很多CRBN潜在配体,并找到了一些高富集度、且双蛋白条件富集度高于单蛋白条件的分子。随后我们通过HTRF实验对这些分子进行了验证,发现了有潜在分子胶活性的小分子(图7)。
图7. GSPT1/CRBN分子胶的In-Solution DEL筛选
与in-solution DEL不同,on-bead DEL则会同时与两种蛋白孵育,随后通过加入能够特异性识别两种蛋白的荧光抗体进行筛选。由于beads的大小适配流式细胞仪的检测方法,两种荧光抗体就会在分选时被APC或者FITC channel检测到。我们通过对APC(+),FITC(+)的筛选后样品进行DNA测序解析,就能找到潜在的分子胶化合物。通过使用CDK12-CyclinK/DDB1分子胶CR-8作为tool compound,与该靶点的negative compound混合后进行筛选验证,FACS明显的显示大量CR-8的信号在APC(+),FITC(+) channel中被检测到,而只用negative compounds或者空白beads的组别在该channel则几乎没有信号被检测到。这些结果证明了药明康德分子胶筛选平台开发的两种DEL筛选方法能够有效地找到分子胶苗头化合物,助力分子胶药物发现(图8)。
图8. CDK12-CyclinK/DDB1分子胶的on-bead DEL验证
2.2 ASMS筛选
亲和力质谱筛选是一种用途广泛的亲和力筛选方法。与DEL筛选不同,ASMS筛选的小分子并未连接在DNA上,而是常规的小分子。目前,药明康德生物学业务平台拥有大小超过27万的小分子化合物库,均可以用于分子胶的筛选。这些化合物包含供应商来源以及药明康德内部的一些化合物。团队对这些化合物进行了严格的筛选和过滤,以保证它们具有良好的理化性质和广阔的化学空间。
分子胶的ASMS筛选方法与in-solution DEL的筛选类似,筛选条件设置双蛋白和单蛋白两种,最终通过双蛋白和单蛋白两个条件的信号响应值对比来筛选出潜在的分子胶分子。
在对CDK12-CyclinK/DDB1进行ASMS分子胶筛选的过程中,筛选团队从药明康德27万的小分子库中随机挑选使用了1000个分子,经过ASMS筛选、Dose-response的ASMS验证、二元复合物结合测试(SPR)、三元复合物结合测试(SPR、HTRF)等一系列实验,发现和验证了两个分子胶苗头化合物(图9)。
图9. CDK12-CyclinK/DDB1分子胶的ASMS筛选
2.3 HTS筛选
HTS筛选是苗头化合物发现的传统方法。药明康德生物学业务平台的高通量筛选不仅包括分子胶亲和力筛选,也包含基于活性(功能性或半功能性)的分子胶筛选。和ASMS筛选一样,高通量筛选也主要使用药明康德生物学业务平台建立的27万种小分子库进行筛选。并已开发了常用的荧光共振能量转移(Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer,TR-FRET)等一系列成熟的筛选方法。
3. 分子胶苗头化合物的验证
药明康德生物学业务平台早期研发团队不仅拥有分子胶药物发现方面的能力,也拥有蛋白质科学、以及化合物验证等相关能力, 形成了分子胶研发的完备Toolbox(图10)。在蛋白质科学方面,对于TPD研究必不可少的E3连接酶蛋白,团队拥有大量的现货蛋白和成熟、高成功率的生产经验,以及配套的X射线晶体学能力。此外,在筛选后的验证能力,药明康德生物学业务平台拥有多种生物物理和生物化学的方法来进行二元和三元复合物的结合验证,以及HiBit和Western blot等降解活性检测方法,以验证这些潜在化合物是否能在细胞内实现生物学功能。
图10. 药明康德生物学业务平台服能分子胶药物研发
参考文献:
[1] Chem. Soc. Rev. 2022, 51, 5498–5517.
[2] Biochemistry. 2023, 62, 601−623.
[3] Science. 2017, 356, eaal3755.
[4] J. Med. Chem. 2021, 64, 1835−1843.
[5] J. Med. Chem. 2021, 64, 10606−10620.
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