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CAR T发展与结构设计十全大总结

2025-01-22

本文原创:张庆峰 本文来源:爱迪尔笔记

嵌合抗原受体T细胞(CAR T)疗法属于过继性T细胞疗法,其概念源于20世纪80年代,最初由以色列科学家Eshhar等人提出,通过将抗体的抗原识别域与T细胞受体结合,使T细胞能够特异性识别并攻击肿瘤细胞。

经过几代技术的迭代,CAR T细胞不断优化,从单一信号到多信号共刺激,再到分泌细胞因子增强功能,如今已成为治疗血液系统恶性肿瘤的重要手段,并在实体瘤治疗中展现出巨大潜力。

1.1 什么是Adoptive T-cell therapy(过继性T细胞疗法)?

过继性T细胞疗法(Adoptive T-cell therapy, ACT)是一种利用患者自身T细胞来治疗恶性肿瘤的细胞免疫疗法。ACT的核心是将患者体内的T细胞分离出来,在体外进行扩增、基因改造或激活,以增强其抗肿瘤能力,然后再回输到患者体内。ACT主要包括以下几种方法:

  1. 肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs):从肿瘤组织中分离出的T细胞,经过体外扩增后回输。

  2. 嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞):通过基因工程技术将CAR导入T细胞,使其能够特异性识别肿瘤细胞表面的抗原。

  3. 转基因肿瘤特异性T细胞受体T细胞(TCR T细胞):通过基因改造使T细胞表达特异性识别肿瘤抗原的TCR。


1.2 Principles of CAR T cells(CAR T细胞的原理)

1.2.1 Structure(结构)

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor, CAR)是一种通过基因工程技术将不同受体的结构域组合而成的人工受体。CAR的结构主要包括以下几个部分:

  • 细胞外抗原识别域:通常来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv),能够以非MHC限制性的方式识别肿瘤细胞表面的抗原。这种非限制性识别方式是CAR T细胞的一大优势,因为许多肿瘤细胞会下调MHC I类分子的表达以逃避免疫监视。

  • 铰链区:连接抗原识别域和跨膜域,为CAR的表达和抗原结合功能提供灵活性。铰链区的长度会影响免疫突触的形成,进而影响CAR T细胞的功能。

  • 跨膜区:将CAR锚定在细胞膜上,其序列通常来源于CD4、CD8或CD28等分子。跨膜区的结构会影响CAR的二聚化,从而可能影响其信号传导。

  • 细胞内信号传导区:包含CD3ζ链和共刺激信号域(如CD28、4-1BB等)。CD3ζ链含有三个免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAMs),在被磷酸化后能够招募激酶并启动TCR信号传导级联反应。共刺激信号域则通过PI3K/Akt、MAPK等信号通路影响T细胞的激活、细胞毒性、增殖、持久性、代谢活性和细胞因子分泌等功能。


1.2.2 CAR signaling(CAR信号传导)

CAR T细胞的激活机制类似于TCR信号传导。当CAR的抗原识别域与靶抗原结合时,CAR会发生多聚化并模拟TCR信号传导。CD3ζ链上的ITAMs被Src家族激酶LCK磷酸化后,招募ZAP70等下游信号分子,进而激活LAT、PLC-γ等信号通路,最终导致NFκB、AP-1和NFAT等转录因子的激活。与TCR信号传导不同的是,CAR信号传导中CD28和4-1BB等共刺激信号域的激活方式也存在差异。CD28信号域的激活依赖于LCK,而4-1BB信号域则与LCK的结合较弱。这种差异导致了两种CAR T细胞在早期激活信号强度、细胞因子分泌、细胞毒性功能和持久性等方面的不同表现。

1.2.3 Mechanism of action(作用机制)

CAR T细胞通过多种机制发挥抗肿瘤作用:

  • 直接细胞毒性:CAR T细胞识别并结合靶细胞后,通过释放穿孔素和颗粒酶(如颗粒酶B)诱导靶细胞凋亡。此外,CAR T细胞还可以通过Fas-FasL轴介导靶细胞死亡。

  • 细胞因子分泌:CAR T细胞激活后会分泌多种细胞因子,如TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6等。这些细胞因子不仅能够增强CAR T细胞的抗肿瘤活性,还可以激活和招募其他免疫细胞(如NK细胞、B细胞和巨噬细胞)参与抗肿瘤反应。然而,细胞因子的大量分泌也可能导致细胞因子释放综合征(CRS)等严重的不良反应。

  • 间接抗肿瘤作用:CD4+ CAR T细胞通过分泌IFN-γ等细胞因子激活巨噬细胞,增强其吞噬功能,并上调肿瘤细胞表面的MHC I类分子表达,从而增强肿瘤细胞对免疫系统的敏感性。此外,IFN-γ还可以通过上调肿瘤细胞表面的Fas受体表达,增强CAR T细胞的Fas-FasL介导的细胞毒性作用。



1.3 Evolution of CAR T cells(CAR T细胞的演变)

1.3.1 First generation(第一代)

第一代CAR的设计灵感来源于将抗体的抗原识别功能与TCR的信号传导功能相结合。其细胞内信号传导区仅包含CD3ζ链,这种设计的CAR T细胞在临床试验中显示出一定的抗肿瘤活性,但由于其增殖能力、细胞毒性功能和持久性有限,治疗效果并不理想。

1.3.2 Second generation(第二代)

为了增强CAR T细胞的功能,第二代CAR在第一代的基础上增加了共刺激信号域(如CD28或4-1BB)。这种设计显著提高了CAR T细胞的增殖能力、细胞因子分泌和持久性。与CD28信号域相比,4-1BB信号域的CAR T细胞在体内具有更长的持久性和更低的激活诱导细胞死亡(AICD)风险,但CD28信号域的CAR T细胞在早期细胞毒性功能上更强。目前,所有已获FDA批准的CAR T细胞产品均采用第二代CAR设计。

1.3.3 Third generation(第三代)

第三代CAR进一步在细胞内信号传导区增加了第二个共刺激信号域(如CD28和4-1BB或OX40等)。这种设计旨在进一步增强CAR T细胞的激活、增殖和持久性。然而,临床试验结果表明,第三代CAR T细胞与第二代相比在疗效和安全性上并无显著差异,因此其优势仍有待进一步研究。

1.3.4 Fourth generation(第四代)

第四代CAR T细胞被称为“TRUCKs”(T细胞重定向用于抗原非限制性细胞因子介导杀伤的T细胞),其特点是CAR T细胞被设计为能够分泌细胞因子(如IL-12、IL-18、IL-15、IL-7、IL-21等)。这种设计的目的是增强CAR T细胞的抗肿瘤功能,并通过细胞因子招募旁观者T细胞参与抗肿瘤反应,从而克服实体瘤中CAR T细胞疗效不佳的问题。此外,针对肿瘤微环境的策略也被纳入第四代CAR的设计中,例如通过表达逆转信号受体(如IL-4R/IL-7R)或分泌抗体来中和免疫抑制因子(如TGF-β)。

IL-12 TRUCKs

  • 性能变化:IL-12是一种强效的促炎细胞因子,能够显著增强CAR T细胞的抗肿瘤活性。它通过激活T细胞和NK细胞,增强IFN-γ的分泌,从而提高细胞毒性功能(Ferlazzo et al., 2004; Kubin et al., 1994)。此外,IL-12可以阻断Tregs的扩增,减少免疫抑制(X. Cao et al., 2009)。

  • 表型变化:IL-12分泌的CAR T细胞倾向于分化为Th1表型,表现出更强的细胞毒性和抗肿瘤能力(Manetti et al., 1993)。然而,IL-12的全身应用可能导致严重的毒性,如肝毒性、肺毒性等(Car et al., 1999)。因此,通过CAR T细胞在肿瘤局部分泌IL-12,可以在减少系统性毒性的同时增强抗肿瘤效果(Chmielewski & Abken, 2015)。


IL-18 TRUCKs

  • 性能变化:IL-18是一种多效性细胞因子,能够增强T细胞和NK细胞的增殖和IFN-γ分泌(Yasuda et al., 2019)。在小鼠模型中,IL-18分泌的CAR T细胞显示出更强的抗肿瘤活性,尤其是对大型实体瘤(Chmielewski & Abken, 2017)。

  • 表型变化:IL-18能够推动T细胞向T-bet高表达、FoxO1低表达的效应细胞表型分化,同时减少M2型巨噬细胞和Tregs的数量,增加M1型巨噬细胞和NK细胞的比例(Chmielewski & Abken, 2017)。这种表型变化有助于增强CAR T细胞在实体瘤中的浸润和抗肿瘤效果。


IL-15 TRUCKs

  • 性能变化:IL-15能够增强T细胞的增殖和细胞毒性功能,同时通过提高granzyme B的表达来维持T细胞的活性(Tamang et al., 2006)。在小鼠模型中,IL-15分泌的CAR T细胞显示出更强的抗肿瘤活性和更长的持久性(Hoyos et al., 2010)。

  • 表型变化:IL-15分泌的CAR T细胞倾向于维持早期记忆细胞(TSCM)和中央记忆细胞(TCM)的表型,这些细胞具有更强的增殖能力和更长的存活时间(Hoyos et al., 2010)。此外,IL-15还能够减少PD-1等抑制性受体的表达,从而增强CAR T细胞的抗肿瘤功能。


IL-7 TRUCKs

  • 性能变化:IL-7是一种重要的细胞因子,能够促进T细胞的增殖和存活,同时具有抗凋亡作用(MacKall et al., 2011)。IL-7分泌的CAR T细胞在体内外均显示出更强的抗肿瘤活性和更长的持久性(L. Li et al., 2012)。

  • 表型变化:IL-7能够维持T细胞的早期分化状态,减少终末分化效应细胞的比例(Schluns et al., 2000)。这种表型变化有助于CAR T细胞在体内长期存活并持续发挥抗肿瘤作用。


IL-21 TRUCKs

  • 性能变化:IL-21是一种多效性细胞因子,能够增强T细胞的增殖、存活和细胞毒性功能,同时维持早期记忆细胞的表型(Hinrichs et al., 2008)。在小鼠模型中,IL-21分泌的CAR T细胞显示出更强的抗肿瘤活性和更长的持久性(Štach et al., 2020)。

  • 表型变化:IL-21能够维持T细胞的早期记忆细胞(TSCM)和中央记忆细胞(TCM)的表型,减少终末分化效应细胞的比例(Hinrichs et al., 2008)。此外,IL-21还能够抑制Tregs的扩增,减少免疫抑制(Attridge et al., 2012)。这种表型变化有助于CAR T细胞在体内长期存活并持续发挥抗肿瘤作用。


IL-10 TRUCKs

  • 性能变化:IL-10是一种具有抗肿瘤活性的细胞因子,能够增强T细胞的代谢适应性和抗肿瘤功能(Fujii et al., 2001)。在小鼠模型中,IL-10分泌的CAR T细胞显示出更强的抗肿瘤活性和更长的持久性(Y. Zhao et al., 2024)。

  • 表型变化:IL-10能够促进T细胞向早期记忆细胞(TSCM)表型分化,增强其代谢适应性和抗肿瘤功能(Y. Zhao et al., 2024)。此外,IL-10还能够减少免疫抑制细胞(如Tregs和MDSCs)的数量,从而增强CAR T细胞的抗肿瘤效果。


1.3.5 Fifth-generation, next-generation(第五代及下一代)

第五代CAR T细胞的设计更加复杂,引入了逻辑门控(如“OR”、“AND”、“NOT”等)的概念,以实现更精准的靶向和更高的安全性。这些设计利用合成生物学和逻辑门控技术,使CAR T细胞能够根据特定的逻辑条件进行激活或抑制。以下是逻辑门控的具体设计和实现:

1.3.5.1 “OR-gate”(或门)

“OR-gate”设计允许CAR T细胞在识别多个抗原中的任意一个时被激活。这种设计可以防止肿瘤细胞通过丢失或下调单一抗原来逃逸治疗。具体实现方式包括:

  • 双靶向:通过共表达两个CAR分子,每个CAR识别不同的抗原。例如,Ruella等(2016)通过共表达针对CD19和CD20的CAR,显著提高了CAR T细胞的抗肿瘤效果。

  • 串联CAR(TanCAR):将两个scFv串联在一起,形成一个双特异性CAR。这种设计允许CAR T细胞在识别任意一个抗原时被激活,并且在识别两个抗原时表现出更强的信号传导(Grada等,2013)。

  • 环状串联CAR:将scFv以环状结构排列,进一步优化了双特异性CAR的设计(Z. Chen等,2023)。


1.3.5.2 “AND-gate”(与门)

“AND-gate”设计要求CAR T细胞只有在同时识别多个特定抗原时才会被激活。这种设计可以减少非靶向组织的毒性,提高治疗的安全性。具体实现方式包括:

  • 组合信号:通过设计两个CAR分子,每个CAR提供一个信号,只有当两个信号同时存在时,CAR T细胞才会被完全激活(Kloss等,2013)。

  • 合成Notch受体(synNotch):通过synNotch系统,CAR T细胞在识别第一个抗原后,会诱导第二个CAR的表达,从而实现“AND-gate”逻辑(Roybal等,2016)。例如,Choe等(2021)利用synNotch系统在治疗胶质母细胞瘤的CAR T细胞中实现了精确的靶向。

  • 3-input AND-gate:Williams等(2020)开发了一种3-input AND-gate系统,通过级联或并行设计,实现了更复杂的逻辑控制。在小鼠模型中,这种系统能够精确识别三阳性肿瘤细胞,并表现出优异的抗肿瘤效果。


1.3.5.3 “NOT-gate”(非门)

“NOT-gate”设计允许CAR T细胞在识别非肿瘤抗原时被抑制,从而避免对正常组织的攻击。具体实现方式包括:

  • 抑制性CAR(iCAR):通过将抑制性受体(如PD-1或CTLA-4)的细胞内信号传导区替换为CAR T细胞的信号传导区,实现对非肿瘤抗原的抑制(Fedorov等,2013)。例如,Aoyama等(2022)开发了一种“Scissor CAR”,通过识别健康细胞表面的抗原,抑制CAR T细胞的激活。

  • OFF-Notch受体:通过设计OFF-Notch受体,当识别到健康组织抗原时,会诱导表达凋亡因子,从而导致CAR T细胞的凋亡(Williams等,2020)。


1.3.5.4 Universal CARs(通用CAR)

通用CAR设计允许CAR T细胞通过适配器分子识别多种抗原,从而实现CAR T细胞的多功能性和通用性。这种设计可以降低治疗成本并提高治疗的灵活性。具体实现方式包括:

  • Fc结合适配器CAR:通过设计CAR T细胞表达Fc受体,使其能够结合抗体药物,从而实现对多种抗原的识别(Kudo等,2014)。

  • 标签特异性适配器CAR:通过设计CAR T细胞识别特定的标签分子(如生物素或FITC),并结合相应的适配器分子,实现对多种抗原的识别(Lohmueller等,2018)。

  • 双特异性分子结合适配器CAR:通过设计CAR T细胞结合双特异性抗体,实现对多种抗原的识别(Choi等,2019)。


1.3.5.5 CAR with JAK/STAT signaling(JAK/STAT信号通路CAR)

通过将细胞因子受体的信号传导域整合到CAR中,CAR T细胞可以在没有外源细胞因子的情况下持续激活。这种设计可以增强CAR T细胞的增殖和持久性(Kagoya等,2018)。

1.3.5.6 Suicide switches(自杀开关)

为了提高CAR T细胞治疗的安全性,研究者们开发了自杀开关技术,通过引入可诱导的凋亡基因或代谢开关,可以在CAR T细胞引起严重不良反应时将其清除。具体实现方式包括:

  • 代谢开关:通过设计CAR T细胞表达代谢酶,使其在特定代谢物存在时发生凋亡(Berger等,2006)。

  • 诱导性凋亡基因:通过设计CAR T细胞表达诱导性凋亡基因(如iCasp9),在特定药物存在时诱导CAR T细胞凋亡(Stasi等,2011)。

  • 表面抗原靶向:通过设计CAR T细胞表达特定的表面抗原,使其能够被抗体药物靶向清除(Griffioen等,2009)。


CAR T细胞疗法作为一种革命性的癌症治疗方法,已经取得了显著的临床疗效,尤其是在血液系统恶性肿瘤的治疗中。然而,CAR T细胞在实体瘤治疗中的应用仍面临诸多挑战,如肿瘤微环境的免疫抑制、CAR T细胞的持久性和安全性等。随着合成生物学和逻辑门控技术的发展,第五代及下一代CAR T细胞设计引入了逻辑门控的概念,通过“OR-gate”、“AND-gate”和“NOT-gate”等逻辑门控,实现了更精准的靶向和更高的安全性。这些设计不仅提高了CAR T细胞的抗肿瘤效果,还减少了对正常组织的毒性。未来,随着技术的不断进步,CAR T细胞疗法有望在更多类型的癌症治疗中发挥重要作用。