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安达望(上海)科技有限公司

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建立基因编辑的iPSC克隆细胞库

2022-06-24

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随着细胞治疗公司计划未来从工艺开发转移到临床制造,他们希望采用稳健的工作流程,以最好地管理产品的一致性、质量,并满足监管要求和最佳生产流程。

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根据我们的经验,对于简单的敲除,需要产生100-150个克隆,才能产生10个适合建库的克隆。对于基因编辑中的多个敲除,可能要求超过1000个克隆,才能产生10个适合建库的克隆。在这种规模下,有限稀释法不是一个切实可行的选择。


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VIPS是一种自动单细胞接种设备,可在非常低的压力下将单个细胞分配到96或384孔板中。VIPS将纳升体积的细胞液滴到微孔,然后z轴叠层拍20张照片来验证孔内是否存在单个细胞,然后应用人工智能来识别是否存在单个细胞、无细胞或多个细胞。VIPS随后会自动向孔中填充培养基,然后整孔成像以支持单个细胞的存在。这种双重时间点的单克隆性图像(双锁验证)是未来向监管部门提供证据的关键组成部分。


我们使用核糖核蛋白(RNP)传递的CRISPR-Cas9技术敲除hiPSC系中的EMX1基因(编码神经元模型形成的转录因子)位点。将核糖体蛋白转染入核后,通过VIPS或有限稀释法(LD)作为对照将hiPSC作为单细胞接种到96孔板中,然后在含有MatriClone的培养基中扩增。在VIPS系统上每天对96孔板进行全孔成像,以确认克隆起源,并跟踪克隆的生长。


VIPS与LD相比,在每个平板上成功获得单克隆的数量提高了3-4倍。在这项研究中,仅仅三块VIPS接种的96孔板就产生了100个单克隆,然后进行选择和基因分型,以确认EMX1基因座中indel(碱基插入或缺失)的形成。两个已确认indel的克隆随后被扩增并进行表征。


结果

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图1。单细胞播种和克隆生长来自gRNA#2种子池。图像来自VIPS软件。


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图2。VIPS群体形态评估,利用神经网络算法检测iPSC汇合度。


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图3。基因编辑的iPSC通过VIPS单细胞接种的效率和克隆生长的示例。


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图4。对分配的液滴进行自动图像分析,可以从多个细胞、空孔和细胞碎片中分离单个细胞,以支持克隆性证据。


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图5。扩增的hiPSC克隆中的indel形成和多能性标记物表达的表征:克隆E2是纯合缺失,两个等位基因上都有一个碱基缺失;克隆F2是一种复合纯合缺失,一个等位基因有2个碱基对缺失,另一个等位基因有10个碱基对缺失。


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图6。为VIPS单细胞铺板的基因编辑的iPSC的建库提供克隆性证据而设计的自动化工作流程。


结论

从扩增的100个克隆中,我们成功地获得了10个合适的克隆。此外,VIPS系统及其基于人工智能的检测为单个细胞的存在提供了高质量的证据,可以从多个细胞和细胞团中准确分辨出单个细胞(图4)。VIPS系统的另一个好处是能够捕捉每天的全孔图像(从第0天开始),除了质量保证外,还可以跟踪克隆生长,以确保单克隆性。重要的是,我们证明了选择用于建库的hiPSC克隆保持了其多能性标记表达和核型的标准特征(图5——其中两个克隆的数据)。


致谢

EverCell Bio是执行该项目和生成数据的合作伙伴。本结果来自EverCell Bio生物公司。



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