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iPSC案例详解之实验篇 | VIPS + MatriClone 双剑合璧!

2023-05-06

实验篇

近年来,越来越多的细胞治疗公司开始从工艺开发转移到临床生产,大家都希望摸索出一条高效且稳定的工艺流程,使研发生产工艺流程一致、可持续且产品质量高,还要满足监管要求,顺利通过相关部门审批。


该实验旨在展示


1

铺板效率高(单细胞铺板%)

2

克隆效率高(单克隆恢复生长率%)

3

产生足够数量的克隆 (>150),为建库提供足够的用于测序的克隆

4

以图像和克隆报告形式作为单克隆证据提供给监管部门

5

符合临床和 GMP 环境的 Matriclone 试剂

6

使用此方法,干细胞多能性和形态均得以保证


材料与方法


VIPS 是一个智能单细胞铺板仪,在非常低的压力下将单个细胞分配到 96 或 384 个孔板中。VIPS 通过对干孔液滴Z轴成像(20层)判断是否存在单个细胞、无细胞或多个细胞。然后,VIPS 自动将培养基添加到孔板中,后获得整孔图像。干孔细胞及整孔细胞成像构成双锁确证,是支持未来监管提交的关键。


iPSC案例详解 | VIPS + MatriClone双剑合璧!搞定那些让您头疼的问题!

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使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 系统敲除 iPSC 中 EMX1 基因。转染后,使用 VIPS 或有限稀释 (LD) 法进行单细胞分离,然后在含有 MatriClone 的培养基中扩增。每天在 VIPS 系统上进行全孔成像,以追踪克隆来源,并跟踪克隆团的生长。正如我们之前发表的文章 (Manos et al.) 所述,与 LD 相比,VIPS 在每个平板上成功从单个细胞中获得的克隆数量提高了 3-4 倍。在本研究中,使用 VIPS 铺了三块 96 孔板,从中选取 100 个单克隆,测序并进行功能验证。


1

选择靶基因位点编辑,设计和准备gRNA

基于之前的工作 (Ran et al., 2013) 我们选择 EMX1 作为靶基因位点,利用 CRISPR/Cas9 进行插入缺失的形成。简单地说,使用 Benchling 基因编辑工具分析兴趣序列 (Hsu et al., 2013),产生多种 gRNA 候选,选择三个目标 gRNA (基于低脱靶率)


2

细胞驯化

在单细胞铺板前,iPSC 至少要在 MatriClone 上传 2 代。使用浓度根据使用说明选择,所用培养基为 mTeSR Plus (StemCell Technologies) 


3

细胞转染及筛选

传代后第 3 天,用 Accutase 分离 iPSCs 单细胞,计数调整。大约 107 个细胞分成三份,分别加入到三个含有 Cas9 和三种不同的 gRNA 的离心管中。使用 NEON 装置进行转染。然后,在 6 孔板中进行培养扩增。培养第 3 天,对含有不同 gRNA 的样本取样,并使用 TIDE 分析评估,分析插入敲除效率最高的是 gRNA#2


4

单细胞铺板

培养第 5 天,使用 gRNA#2 插入的细胞进行 VIPS 铺板(图1)。首先制作单细胞悬液,用 Accutase 进行消化, Spectra (Nexcelom) 进行活细胞计数,细胞活率为 85%。在 mTeSR Plus 中将细胞浓度调整至约 10,000个/ml 以获得最佳铺板效率。将 Matriclone 直接添加到培养基中,然后由 VIPS 细胞池喷嘴分配到每个孔中。 总共铺 5 块板。加入含有 MatriClone 和 CloneR 的培养基 125 μl/ 孔。铺板后第 1 天和第 3 天,每孔加 50 μl,铺板后第 5 天完全换液,培养至第 12 天


5

克隆增值

第 12 天,根据 hiPSC 克隆形态选择克隆 (图2) 。使用 EDTA 消化单克隆,之后转移至 6 孔板,最终选择 10 个有插入的 hiPSC 克隆被进行低温保存和鉴定


6

测序

收集单克隆样本进行 DNA 提取,PCR 扩增兴趣序列,用于 Sanger 测序,然后通过 TIDE 分析插入缺失。选择了大约 96 个克隆进行初步筛选,其中 10 个样本被发现具有合适的基因编辑剖面,并在随后的传代中继续进行确认


7

多能性标记基因表达鉴定,核型鉴定

按照之前的方法进行实验1。使用 ICC/IF 来鉴定干性标记基因 Nanog 和 Tra-1-60 。通过G显带对 hiPSCs 进行核型分析


8

结果


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图 1:单细胞铺板及克隆生长结果。图像来自 VIPS 软件界面


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图 2:克隆形态追踪,VIPS 自带 IPSC 汇合度自动识别功能,识别从单细胞到克隆团的形成过程


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图 3:单细胞铺板效率及恢复生长率


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图 4:干孔内自动识别液滴内单细胞或多个细胞


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 图 5:使用 ICC/IF 鉴定的干细胞克隆干性标记基因表达图像


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图 6:使用 VIPS/Matriclone 优化的 iPSC 工作流程


结果与结论


我们曾经证明使用 VIPS 和 MatriClone 可以显著改善 iPSC 单细胞克隆工作流程,与限制稀释相比,每 96 孔板的克隆数量显著增加1。iPSCs 的基因编辑进一步增加了这一工作流程的复杂性,编辑和多次编辑对细胞的损害很大,如果要获得足够的健康的克隆,需要筛选更多的克隆,更高程度的自动化,并在分离单克隆时记录证据,以便这些数据可以作为 IND (研究性新药) 申请的一部分进行提交。


在本研究中,我们使用 VIPS/MatriClone 组合展示了一个具有代表性的基因编辑工作流程。使用 VIPS 的铺板效率平均为 65% (图3) 。我们成功的从 100 个克隆中获得了 10 个合适的克隆。此外,VIPS 结合其基于人工智能的检测提供了单个细胞存在的高质量证据,准确地辨出单个细胞 (图4) 。


此外,VIPS 能够从第 0 天开始对全孔进行成像,除了保证质量外,还可以跟踪克隆的生长,以保证克隆性。我们还对干性标记基因和核型进行了验证,发现使用改进的工艺流程对其没有任何影响 (图5) 。除了 VIPS 的技术优势,我们可在短短25天内完成从基因编辑到建库的整个流程(图6) ,提高效率和减少材料,我们估计这比常规的工作流程可减少 50% 的时间。我们相信这个工作流程将成为高质量细胞治疗实验室的标准流程。


致 

感谢 EverCell Bio

提供数据


参考文献:

1. Manos et al. Standardizing the process for viable, high efficiency single cell cloning of hiPSCs whilst ensuring maintenance of phenotype. https://www.solentim.com/standardizing-the-process-for-viable-high-efficiency-single-cell- cloning-of-hipscs-whilst-ensuring-maintenance-of-phenotype/

2. Ran, F., Hsu, P., Wright, J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281–2308 (2013). https://doi. org/10.1038/nprot.2013.143

3. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol 31, 827–832 (2013). https://doi.org/10.1038/nbt.2647

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