通过借助人体自身的免疫系统发挥对肿瘤细胞的杀伤作用，免疫细胞疗法有望成为“治愈”癌症的突破性策略。其中，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T）已经在多种血液肿瘤的治疗上取得了瞩目的效果，截止到今年，全球已经有7款CAR-T细胞治疗产品上市，其中包括在中国上市的3款。

CAR-T细胞疗法千里之行，始于基础研究每一个稳扎猛打的环节。其研究流程一般包括CAR分子的设计、慢病毒包装、CAR-T细胞构建、体外体内杀伤验证等。但与小分子或抗体药物不同的是，CAR-T是一种“活的”细胞类药物，想要构建出有效且稳定的CAR-T细胞，需要充分考虑诸多因素，如CAR分子结构的合理设计、T细胞转染条件的摸索、CAR-T细胞的鉴定等。

基于在肿瘤免疫领域多年的研究经验，赛业生物搭建了CAR-T细胞治疗体内体外一站式服务平台，可为科研工作者提供从scFv序列筛选、CAR分子设计到体外体内杀伤实验的全流程服务，帮助客户提升CAR-T/NK相关研究的效率和精准度。欢迎拨打400-680-8038或邮件至info@cyagen.com或点击在线咨询联系我们。

CAR-T细胞治疗体内体外一站式服务平台

赛业生物平台服务优势

案例展示

1. CAR分子设计及慢病毒包装

对于CAR-T细胞治疗，CAR分子是影响治疗有效性的关键。CAR分子结构包含识别肿瘤抗原的抗体单链可变区、铰链区，以及胞内的共刺激结构域、信号传导域，其设计的合理性会影响CAR-T细胞的杀伤效应、体内持久性、以及安全性等。因此，针对不同的肿瘤治疗靶点，我们需要设计合理有效的CAR分子，并包装成CAR慢病毒，用于后续CAR-T细胞的构建。

• CD19抗原慢病毒包装及滴度检测

将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释（0.01、0.1、1、10 μl），分别加入到相同数量的293T细胞中，72小时后流式检测293T细胞阳性率，进而按如下公式计算慢病毒的转导滴度：

图1 CD19抗原慢病毒滴度检测结果

如图所示，CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高，表明该慢病毒有良好的感染活性，并按上述公式计算病毒滴度为：1.4×10⁸ Tu/ml。

•  CD19-293T稳转细胞株构建

我们将成功制备的上述CD19病毒转染293T细胞，经过多轮筛选获得阳性率几乎为100%的CD19-293T细胞，其阳性率检测结果如下图所示。

图2 CD19-293T稳转细胞株阳性率检测结果

• CD19-CAR慢病毒包装及滴度检测

我们将针对CD19靶点设计的二代经典CAR分子构建到慢病毒载体中，并包装得到CD19-CAR慢病毒，采用上述方法检测病毒滴度，经计算后得到病毒滴度为：4.33×10⁸ Tu/ml。

图3 CD19 CAR分子结构，

其中VH和VL序列来源于CD19抗体FMC63克隆

图4 CD19 CAR慢病毒滴度检测结果

• 其他慢病毒感染

图5 其他细胞慢病毒感染效果图

2. CAR-T细胞制备

在完成CAR病毒的包装后，下一步需对T细胞进行细胞转染，从而获得CAR-T细胞。

我们建立了两种不同的高效的T细胞制备方法，均能制备高纯度的T细胞（CD3+细胞占比可达98%以上），但二者扩增出来的不同亚型T细胞的占比有较大的差异，Method 1扩增出来的T细胞以CD8+T细胞亚型为主，而Method 2可扩增出CD8+T细胞和CD4+T细胞占比差异较小的T细胞群体，这两种方法为研究不同亚型T细胞的作用奠定了坚实的基础。

图6 T细胞表型分析实验结果

慢病毒是目前构建CAR-T细胞的重要基因递送工具，不同的T细胞活化扩增方法、不同的转染时间等多方面因素都会影响CAR-T细胞的阳性率。我们通过多方面的实验条件优化，成功建立了高效的基于慢病毒转染的CAR-T细胞制备工艺。下图展示的是CD19 CAR-T细胞阳性率检测结果，该结构中使用了来源于CD19抗体FCM63克隆的scFv，因此可通过抗FMC63 scFv抗体对其转染效率进行检测，结果表明CD19 CAR-T细胞的阳性率可达45.59%，表明成功构建了阳性率较高的CD19 CAR-T细胞。

图7 CD19 CAR-T细胞阳性率检测结果

3.   体外药效评价

构建好CAR-T细胞即可进行相关的药效评价，通常采用不同的效靶比，观察CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。我们将CD19 CAR-T细胞和T细胞分别以不同效靶比同Nalm6细胞共孵育48 h，采用流式法检测肿瘤细胞凋亡。如图所示，与T细胞组相比，不同效靶比条件下，CD19 CAR-T细胞均展现出了对Nalm6细胞明显增强的特异性细胞毒性作用。

图8 FMC63 CAR-T细胞杀伤Nalm6肿瘤细胞实验结果（A. Nalm6细胞表面CD19抗原阳性率检测结果；B. CD19 CAR-T细胞杀伤Nlam6细胞实验结果；C. CD19 CAR-T细胞杀伤Nlam6细胞培养上清中IFN-γ含量检测结果）

技术指标

应用