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AAV衣壳定向进化
Vectorbuilder
AAV(CRO)
重组AAV病毒由于其多样的组织嗜性、长时间的转基因表达效果、非致病性以及低免疫原性等特点,作为一种基因递送载体被广泛用于基因治疗和疫苗开发。
既有的AAV血清型存在一定的问题影响了其用于基因治疗的潜力。首先,尽管现有的血清型提供了一系列组织嗜性以供选择,但是在临床应用上仍然具有一些类型的组织是这些血清型的特异性无法覆盖的。第二,尽管一些特定血清型的AAV可特异感染靶组织,但是其基因递送效率可能偏低,或者具有脱靶效应感染其他组织。第三,体内预先存在针对多种AAV血清型的中和抗体将从一开始或者多次给药后阻碍AAV的感染。最后,一些AAV血清型类型相比其它类型更难在生产中获得高的滴度、纯度和稳定性。为克服这些问题,AAV衣壳开发在加速获得新型AAV突变体、改善AAV性能方面一直是相当重要的技术。
定向进化是一种常用于提高生物大分子性能的高通量方法。该方法模拟自然选择过程并将其所耗时间大幅缩短。AAV衣壳定向进化通过突变野生型AAV衣壳基因,获得具备高度多样性的AAV衣壳文库,然后从中筛选出全新的、性能更优越的AAV衣壳。由于定向进化不需要具备蛋白结构与功能相关的先验知识,因此在新型AAV衣壳开发上相对于理论设计方式更具优势。
关于CRO项目的服务咨询请发邮件至cro@vectorbuilder.com。如果您有更多相关问题,请点击联系我们。
云舟官网详情:AAV衣壳定向进化-云舟生物 (vectorbuilder.cn)
咨询电话:18127926965
全方面的服务平台:载体家是当前全球唯一一家具备AAV临床前、临床CRO和CDMO一站式服务的企业。我们的AAV相关服务涵盖载体设计、载体优化、载体克隆、文库构建、病毒包装、衣壳定向进化和工程改造、AAV组织分布鉴定、GMP病毒生产等。
多策略定向进化构建衣壳高度多样性的病毒文库:我们在文库构建方面的丰富经验,可以帮助您通过定向进化以及其结合方法进行自定义设计,以获得极具病毒衣壳多样性的文库。
文库病毒高滴度包装:我们可使用一步法或两步法包装文库病毒,并保证每种衣壳或基因组发生突变的病毒均具有很高的滴度。
使用包括非人灵长类(Non-human primate,NHP)在内的多种模式生物进行体内筛选:除了进行体外筛选,我们还提供一系列模式生物用于进行体内筛选,如小鼠、大鼠、以及重要的两种非人灵长类:食蟹猴(Macaca fascicularis)和猕猴(Macaca Mulatta)。所有体内筛选试验均在经过AAALAC认证的机构中以专业认可的方式进行。
完善的技术支持:我们的科学家在AAV衣壳开发项目上具有深厚的经验,能够为您提供全面的技术支持,包括从文库设计、文库构建到体内筛选以及NGS分析。
实施AAV衣壳定向进化的第一步也是最关键一步是制备高度多样性的AAV转移载体文库,每个载体上包含一个嵌合型AAV基因组:含有一个rep基因和一个突变cap基因。现今已有多种方式可以高效制备这种突变cap基因,比如易错PCR(Error-prone PCR)、随机多肽展示(Random peptide display)、家族DNA洗牌(DNA family shuffling)、以及计算机设计(In silico design)等。转移载体被包装成病毒颗粒,每个病毒颗粒的基因组包含一个突变cap基因。文库中这些混杂的嵌合型病毒随后被筛选并测试以下方面:一、高效转导特定组织或器官的靶细胞;二、高度亲和细胞特异性表面受体;三、能够逃避中和抗体。经过筛选后的的病毒基因组从靶细胞中复原,然后被用于构建一个新的更小的文库用于第二轮筛选,并在多个筛选周期后得到某种富集的突变型衣壳。该基因克隆经过验证即认为发现了一种新型的具有更强性能的变异AAV衣壳(图1)。
图1 AAV衣壳定向进化的典型筛选流程
以下策略常用于制备突变型AAV衣壳。用于筛选的衣壳文库通过大规模并行克隆AAV载体获得。这些载体均包含了嵌合型的AAV基因组(每个载体包含一个rep基因和一个突变cap基因)。
易错PCR
易错PCR是最直接用于开发高度多样化的AAV衣壳的选择,这其中包括从修改标准PCR方法到突变AAV衣壳基因等多种方式。更具体而言,易错PCR结合了多种次优化的PCR条件,如使用低保真性聚合酶、更长的延伸时间、更高的Mg2+浓度、添加Mn2+,以及使用不相等的多种dNTP浓度等方式来对AAV衣壳基因引入随机突变。
随机多肽展示
随机多肽展示通常使用7到9个随机多肽序列插入到AAV衣壳蛋白序列的特定位点,以达到改变病毒与特定细胞表面受体的天然相互作用的目的。插入的多肽一般位于AAV衣壳暴露此段多肽的位置或者介导病毒与细胞相互作用的关键位置。例如,AAV2衣壳蛋白的587位到588位氨基酸(位于VRIII可变区)是一个适用于AAV2多肽展示文库的插入位点。在此位点插入多肽可以阻碍与AAV2作用的硫酸类肝素多糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)模体的功能(HSPG是识别AAV2的主要细胞表面受体),并促进展示的多肽与细胞表面分子相互作用。
家族DNA洗牌
家族DNA洗牌是一种通过不同AAV血清型的亲本衣壳基因分子杂交产生嵌合AAV衣壳的高效方法。为了实现这一点,将不同AAV血清型的亲本衣壳基因碎片化,然后通过无引物PCR利用部分序列同源性将其重组为新型AAV衣壳。作为一种替代策略,还可以通过综合洗牌法与其他设计方法创建高复杂性的文库,即将理论设计(基于AAV生物学的先验知识修改衣壳序列)与定向进化相结合。在这种方法中,为发现和评估适合进行突变的衣壳位点,将首先对天然血清型的AAV衣壳的精细结构和序列进行分析。这些含有突变的基因碎片最后将合成为全长序列,并用于组装新型AAV衣壳。
计算机设计
现今已有多种计算机方法可用于预测促使AAV性能得到加强的衣壳序列。其中一个常用的方法是祖先衣壳重建,涉及多个计算机设计的祖先AAV衣壳文库的构建,然后进行实验验证以发现组织嗜性得到改进的衣壳序列。该方法背后的机理在于经自然选择留下的AAV进化中间体大概率上已演化出独特的性状,并且仍然能维持病毒的结构和功能。另一方面,机器学习则是另一种广泛使用的计算机设计方法,根据输入的大量蛋白质结构与功能的关系数据来预测新型AAV病毒衣壳的组装。
衣壳文库的病毒包装可以划分为一步法或者两步法,如下所述:
一步法包装衣壳文库
包装AAV衣壳文库的传统方法是采用一步法:衣壳文库和腺病毒辅助质粒共转染包装细胞。虽然这种方法被广泛使用,但它确实存在交叉包装(具备衣壳变异体的AAV颗粒其基因组和衣壳类型不匹配)和衣壳镶嵌(AAV的衣壳组分来源于多种变异体)的缺点。为了克服这些问题,建议以极低的文库质粒数/细胞数比率转染包装细胞,以确保每个细胞至多吸收一个文库质粒。
两步法包装衣壳文库
在两步法包装中,衣壳文库首先与编码野生型衣壳基因但缺少病毒ITR的辅助质粒共转染至包装细胞中。这将产生带有镶嵌型衣壳的AAV颗粒,这种部分由野生型VP蛋白组成的衣壳被称为AAV转移穿梭机(AAV transfer shuttle)。将此种AAV以低感染复数转导包装细胞,以实现每个细胞至多感染一个病毒颗粒。随后用野生型腺病毒对包装细胞进行双重感染,最终产生高滴度病毒衣壳文库。
为获得带有期望性状的嵌合型AAV,根据筛选目的病毒衣壳文库通常需要经过在体外或者体内的多次筛选:
体外筛选
利用已建立的细胞系筛选AAV衣壳文库是一种常用的体外筛选方法,特别是用于发现靶向受体能力发生变化的衣壳突变型AAV。AAV文库的体外筛选快速且技术简单,但是也存在一定的问题。首先,针对体外高转导效率优化的载体在体内使用时可能无法重现相同的效率。其次,在体外表现出对靶细胞高度特异性的AAV载体在体内时可能会转导非靶组织。体外筛选AAV文库的另一种策略是在感染靶细胞之前,将AAV文库加入免疫动物的强效血清中以辨别具有免疫逃避属性的突变型衣壳。然而,在体内实验时衣壳突变的AAV引发免疫反应类型可能并不一致(即使同样的AAV载体,通过不同途径输送也可能会产生不同的免疫反应)。
体内筛选
体内动物模型为筛选AAV文库提供了更可靠的平台,特别是用于寻找那些需要转导体外难以培养的细胞的或者需要转导复杂组织结构中的特定细胞的AAV突变体。体内筛选还有助于发现与AAV突变体相关的任何的潜在脱靶效应。小鼠和NHP均广泛用于AAV文库的体内筛选,但是NHP模型由于与人类的高度相似,因此是筛选与临床应用相关的改良型AAV载体的最佳平台。
技术指标
应用
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