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想快、想全、还想省钱？CFPS让酶筛选不再做选择题
酶是生物催化领域的核心生产力，全球工业酶市场规模持续攀升，新酶发现与定向进化已成为生物制造、医药合成、绿色化工等赛道的竞争焦点。然而，"先表达、再筛选"的经典范式几乎完全依赖活细胞——把目标基因克隆进质粒、导入宿主菌、培养扩增、诱导表达，最后才能进行活性检测。这一流程看似成熟，实则暗藏多重瓶颈，直接拖慢了"从基因到功能"的转化速度。
今天小编和大家分享一篇发表在Biotechnology Advances上的综述文章——“Cell-free platforms for flexible expression and screening of enzymes”，该文章系统梳理了无细胞蛋白合成（CFPS）技术在酶的表达与筛选中的独特价值。
一、研究背景
在酶工程领域，"发现新酶"和"改造旧酶"都离不开两个核心步骤——表达与筛选。谁能更快地完成"基因→蛋白→功能验证"的闭环，谁就能在竞争中抢得先机。传统依赖活细胞宿主的酶筛选存在三大困境：
依赖活细胞，周期冗长：目标基因需先克隆、转化、培养，周期以"周"计，克隆与扩增环节耗时费力，难以满足高通量需求。
底物受限于细胞膜：基于细胞的筛选，只有能穿过细胞膜、进入胞内的底物才能与目标酶相遇并被检测，大量有价值的工业底物被天然排除在外。导致许多酶的真实底物谱被"裁剪"，筛选结果难以反映酶的真实性能。
毒性蛋白与代谢干扰：对细胞有毒性的目标酶无法在活细胞中表达；即便能表达，目标酶的活性也不能干扰细胞正常代谢，筛选条件被迫限制在生理耐受范围内。
正是由于"活细胞"所衍生出的固有矛盾，让传统酶筛选陷入了"想快快不了、想全全不了"的困境。而要打破僵局，关键在于把蛋白合成从细胞中"解放"出来。
二、无细胞蛋白表达技术
CFPS 系统利用细胞提取物中的核糖体与翻译机器，在体外直接将遗传信息转化为蛋白质。它不受细胞活力与膜完整性的约束，反应条件可自由调控，蛋白合成可在数小时内完成，且开放体系支持均相溶液、人工囊泡、凝胶固相等多种反应形式。
图1：CFPS系统可在溶液相、人工囊泡、凝胶固相等多种反应形式中灵活应用
本文回顾了决定无细胞系统能否"实用化"的能量供给问题——从丙酮酸氧化酶介导的 ATP 再生，到直接利用葡萄糖糖酵解、甚至麦芽糊精和可溶性淀粉供能，这些进展使无细胞系统的产量与成本得到了实质性优化，让其真正成为可规模化应用的技术平台。这些突破显著提升了无细胞系统的产量与成本效益，并拓展了CFPS技术从高通量基因表达到大规模蛋白质生产的应用范围。
三、CFPS技术应用优势
1.PCR 产物即模板
传统流程中，模板 DNA 必须先克隆进质粒，而无细胞系统可以直接"翻译" PCR 扩增的线性 DNA。针对线性 DNA 易被核酸酶降解的问题，已有多种成熟对策，如：利用 λ 噬菌体 Gam 蛋白抑制 RecBCD 核酸外切酶、用改造菌株制备细胞提取物、为 mRNA 设计保护性茎环结构等。这意味着，从菌落到蛋白表达，可以完全免去克隆步骤。
图2：提高无细胞蛋白质合成反应中模板稳定性的策略
2.免克隆酶筛选
Kwon 等人成功应用了不依赖克隆技术的无细胞表达策略，从多种微生物物种的推定基因中鉴定出新型酶类。研究人员从微生物菌落中直接 PCR 扩增 11 个 ω-转氨酶基因，在无细胞体系中表达后，针对 16 种氨基供体底物进行活性筛选，仅数小时就鉴定出多个酶-底物匹配关系。
图3：酶的非克隆依赖性表达筛选
3.宏基因组挖掘
Clark 团队从牛瘤胃微生物组中筛选糖苷水解酶时，设计了一个检测系统：有活性的酶水解聚糖释放单糖，单糖被体系代谢产生 ATP 继续驱动蛋白合成，同时酸性代谢物积累导致 pH 下降，通过检测 pH 变化来鉴定多种聚糖水解酶。在这一体系中可无缝衔接表达、筛选、信号读出。
4.突变体文库的高通量筛选
在定向进化场景中，无细胞系统同样表现出色。SIMPLEX（单分子PCR联用体外表达）技术将基因池稀释至单分子水平，经单分子 PCR 扩增后在微孔板中进行无细胞表达；此外，体外区室化（IVC）可将单个突变基因封装进油包水液滴，重建"基因型—表型"关联，Swartz 团队将该技术成功应用于[FeFe]氢化酶的定向进化研究；Park 等人对南极假丝酵母脂肪酶 B（CalB）热点区域进行随机化处理、转化大肠杆菌分离变体后再进行菌落 PCR，最后在微孔板中无细胞表达，数小时内即完成突变体文库的筛选。
图4：无细胞体系中分子集落的表达
5.非蛋白质类物质的无细胞合成
细胞粗提物中的代谢酶并非简单的"杂质"，它们也构成了静默的代谢途径，这些途径可针对特定目的重新激活。利用细胞提取物中所含的细胞酶构建的合成途径，可在表达需要辅基的复杂酶时用于合成非蛋白质类物质。Kwon 等人在同一体系中同步合成血红素辅基与脱辅基蛋白，直接获得有活性的 P450 单氧酶。Bujara等人利用无细胞代谢网络生产精细化工中间体——二羟基丙酮磷酸（DHAP）。Zhang 等人揭示了利用廉价碳水化合物在无细胞体系中制备氢气及其他生物燃料的可行性。这些研究说明CFPS技术为复杂酶（需要辅基的金属酶、膜蛋白等）的筛选提供了全新可能。
图5：整合CFPS制备人工化学物质与脱辅基酶，用于复杂酶的表达
四、结语
CFPS技术为调控反应条件及蛋白质合成形式提供了广泛的灵活性。随着高效且经济的能源供应方法与提取制备方法的发展，CFPS技术已被视为替代基于细胞表达系统的另一种选择。 在2026年的今天，当企业面对"新酶挖掘慢、定向进化贵"的困局时，不必在"快"与"全"之间做选择题。依托成熟的 CFPS 平台，珀罗汀生物可为客户提供酶文库无细胞快速表达与活性筛选、毒性蛋白/膜蛋白等"难搞"靶点的定制方案，帮您把表达周期从"周"压缩到"天"。
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