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“药靶之王” GPCR 难表达？CFPS如何破解七次跨膜蛋白的表达困局
全球获批药物中约有三分之一以G蛋白偶联受体（GPCR）为靶点——降压药、抗组胺药、β受体阻滞剂，至近年来火遍全球的司美格鲁肽、替尔泊肽等GLP-1类减重药，都出自这个庞大家族。 然而，正是这群"药靶之王"，长期是蛋白表达领域公认的"硬骨头"：七次跨膜的拓扑结构、强烈的疏水性、柔性的胞内环区以及对翻译后修饰的依赖，让它们在活细胞中极易错误折叠、产量极低甚至产生细胞毒性。 传统真核表达周期长、成本高，原核细胞内表达又常常只能得到无活性的包涵体。当"用细胞表达蛋白"这条路越走越窄，一个反直觉的答案浮现出来——干脆不要细胞。 图1:GPCR结构示意图 一、GPCR：药物靶点之王，为何"难表达"？ GPCR是人类基因组中最大的膜蛋白家族，介导细胞外信号向胞内的传递，覆盖众多生理过程，比如感光、嗅觉、行为和情绪的调节、免疫系统的调节、自主神经系统的调节等等。正因如此，它也是新药研发最集中的靶标之一。但科研与产业化需求越大，表达瓶颈就越突出：GPCR需要正确的膜拓扑、脂质环境和翻译后修饰才能获得天然构象；在细胞中过量表达常触发未折叠蛋白反应，导致产量骤降；即便勉强表达，去垢剂增溶与纯化过程中的构象不稳定又会让后续结构解析和活性检测难上加难。可以说，获得"足够量、有活性、可操作"的GPCR样品，一直是受体研究的第一道门槛。 二、无细胞表达：绕开细胞，直接"装配"膜蛋白 无细胞蛋白表达（Cell-free protein synthesis, CFPS）利用大肠杆菌等原核来源的裂解物，在体外直接完成转录与翻译。它的核心优势在于开放体系：表达环境可以人为设计，模板DNA可以平行批量测试，产物无需破胞即可回收。对膜蛋白而言，最关键的突破是"共翻译膜插入"——在反应体系中直接加入纳米盘、脂质体或去垢剂，让新生多肽边合成边嵌入脂双层，从源头上规避了细胞内的毒性积累与错误折叠。 三、从毫克到结构：原核无细胞合成的GPCR登上冷冻电镜 如果说此前无细胞表达还停留在"产得出来"的层面，2024—2025年的两项工作则把它推向了"看得清楚"的新高度。 2024年，德国科学家团队报道了首个完全由大肠杆菌无细胞系统合成的人组胺H2受体（H2R）与Gs蛋白复合物的冷冻电镜结构：受体在纳米盘环境中共翻译组装，与Gs形成完整信号复合物，分辨率达到3.4埃左右，配体结合口袋与G蛋白偶联界面清晰可辨[1]。 2025年，同一团队更进一步，解析了无细胞合成的全长人β1肾上腺素受体与Gs复合物的结构，甚至连此前结构生物学中常常缺失的第三个胞内环（ICL3）都得以呈现[2]。 这两项工作证明：原核体系无细胞合成的GPCR不仅功能完整，而且完全有能力支撑高分辨率结构解析——这对孤儿受体、毒性受体等"常规方法不可得"的靶标而言，意义不言而喻。 图2：通过无细胞表达对复合物进行冷冻电镜样品制备[1] 四、功能研究：膜环境中的"原生态"GPCR 结构之外，功能研究同样受益于原核无细胞平台。GPCR产量不足是长期痛点，2023年有团队通过设计小型表达标签，在E. coli无细胞中显著提升了多种GPCR的表达水平，为功能与结构研究提供了充足样品[3]。 2024年，一项面向"小膜蛋白"的无细胞功能研究体系进一步展示了该平台的灵活性——以大肠杆菌小膜蛋白MgrB、SafA、AcrZ等为对象，在无细胞系统中完成合成、膜嵌入与功能检测的全流程，甚至实现了人源小膜蛋白的微摩尔级制备[4]。 图3：通过无细胞表达合成小膜蛋白[4] 同年，还有团队将石英晶体微量天平（QCMD）与E. coli无细胞表达联用，实现了膜蛋白插入过程的实时、无标记监测[5]。这些方法学进展，让GPCR等膜蛋白的配体结合、通道活性乃至变构调节研究都能在可控的体外环境中进行。 图4：TXTL（无细胞转录-翻译）-QCMD 实验程序的工作流程[5] 五、药物发现：高通量与可编程 对药物研发而言，无细胞表达的价值还在于速度与通量。开放体系天然适配自动化：同一批次可平行表达数十至上百个受体变体，配合高通量结合筛选，能够在数天内完成传统方法数周的工作量，这在针对GPCR的抗体发现、变构调节剂筛选等场景中极具吸引力。 更进一步，无细胞合成正与合成生物学融合——2025年的一篇综述指出，CFPS与囊泡递送平台的融合，正推动治疗性蛋白的"按需制造"与靶向递送[6]。随着无细胞合成生物学走向标准化与自动化，有观点认为其将在生物制造领域扮演越来越核心的角色[7]。对于GPCR这类"难啃"靶标，这条"去细胞化"的路径，正在从实验室工具演变为产业级解决方案。 图5：基于CFPS与囊泡递送平台的药物递送系统示意图[6] 结语 从2024年H2R/Gs复合物冷冻电镜结构的横空出世[1]，到2025年全长β1AR的完整解析[2]，原核无细胞蛋白表达技术用两年时间，在GPCR这个最难攻克的领域接连交出答卷。 当"没有细胞"也能合成并装配出功能完整的七次跨膜蛋白，GPCR研究的想象力边界，正在被重新定义。对于每一个被表达问题困住的研究者来说，这句话或许值得记住：当你无路可走时，试试不要细胞。 珀罗汀生物深耕无细胞蛋白表达技术，自主研发了 SSTR2、C5AR1、Claudins 等多种热门靶点蛋白，充足现货供应；可承接各类膜蛋白表达纯化定制开发。 参考文献 [1] Köck Z, Schnelle K, Persechino M, et al. Cryo-EM structure of cell-free synthesized human histamine 2 receptor/Gs complex in nanodisc environment. Nat Commun. 2024;15:1831. doi:10.1038/s41467-024-46096-z [2] Merino F, Köck Z, Ermel U, et al. Cryo-EM structure of a cell-free synthesized full-length human β1-adrenergic receptor in complex with Gs. Structure. 2025;33:1867-1877.e5. doi:10.1016/j.str.2025.07.020 [3] Cho S, Lee H, Han YH, et al. Design of an effective small expression tag to enhance GPCR production in E. coli-based cell-free and whole cell expression systems. Protein Sci. 2023;32(12):e4839. doi:10.1002/pro.4839 [4] Jiang S, Çelen G, Glatter T, et al. A cell-free system for functional studies of small membrane proteins. J Biol Chem. 2024;300(11):107850. doi:10.1016/j.jbc.2024.107850 [5] Khakimzhan A, Izri Z, Thompson S, et al. Cell-free expression with a quartz crystal microbalance enables rapid, dynamic, and label-free characterization of membrane-interacting proteins. Commun Biol. 2024;7:1005. doi:10.1038/s42003-024-06690-9 [6] Kim W, Han J, Chauhan S, et al. Cell-free protein synthesis and vesicle systems for programmable therapeutic manufacturing and delivery. J Biol Eng. 2025;19:55. doi:10.1186/s13036-025-00523-x [7] Lu Y. The future of cell-free synthetic biology. Biotechnol Notes. 2024;5:A1-A3. doi:10.1016/j.biotno.2024.11.001
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