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中检院实证｜瑞孚迪HTRF赋能QC活性检测：效率提升、精准度保障，加速生物药合规放行
在生物制药质量控制（QC）放行检测中，活性检测（Potency Assay）是衡量产品批间一致性、确保疗效的关键环节。传统ELISA方法虽然经典，但其繁琐的洗涤步骤、较长的操作周期以及较高的变异系数，始终困扰着QC实验室的效率和数据可靠性。而瑞孚迪（Revvity）的均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF) 的技术正在悄然改变这一局面。
HTRF技术凭借其免洗、高灵敏、高通量、信号稳定和易于自动化等核心优势，正在成为生物制药QC放行检测中不可忽视的利器。从单克隆抗体到融合蛋白，从胰岛素类似物到复杂生物制品，大量研究已证实HTRF方法在专属性、准确性、精密度和线性等方面完全满足药典验证要求，且结果与传统ELISA等效甚至更优。
HTRF技术原理
HTRF是一种结合了时间分辨荧光（TRF）与荧光共振能量转移（FRET）的均相检测技术。
在HTRF体系中，使用镧系元素（如铕Eu³⁺、铽Tb³⁺）的穴状化合物作为荧光供体，其荧光寿命长达毫秒级，远超普通荧光染料的纳秒级。检测时，通过设定几十微秒的时间延迟，短寿命的背景荧光信号几乎完全衰减，而长寿命的供体荧光信号得以被精确捕捉，从而显著提高信噪比。
当供体（镧系化合物）与受体（如XL665或d2染料）距离接近（<10 nm）时，供体的能量通过非辐射方式转移至受体，激发受体发出特定波长的荧光信号（如665 nm）。荧光信号强度与待测生物分子的结合或活性呈正相关，从而实现精准定量。
图1. HTRF原理图
HTRF与ELISA方法学对比
与传统ELISA相比，HTRF在QC放行场景中的优势体现在多个维度：
阿达木单抗结合活性的对比研究明确证实，HTRF法与ELISA法测得的结果等效，可以完全替代ELISA用于该类单抗的结合活性测定[1]。
图2. HTRF检测阿达木单抗结合活性原理
表1 HTRF检HTRF与ELISA法测定同一批样品的结果比较
表2 HTRF与ELISA法测定10批样品的结果比较
HTRF在QC放行中的应用案例
案例1：抗PD-1/PD-L1单抗药物活性检测
中检院单抗室成功地构建了抗PD-1/PD-L1单抗药物活性检测方法，其操作简便易行，专属性强，准确性和精密度良好，回收率在80%~120%范围内，总RSD为13%，线性相关系数在0.99以上，满足测定的要求，可用于单抗药物的活性检测，也为其他单克隆抗体活性测定方法的建立提供参考[2]。
图3. HTRF检测PD-1/PD-L1原理
案例2：替度格鲁肽生物学活性检测
中检院梁成罡团队建立了检测替度格鲁肽体外生物学活性的HTRF法，通过竞争性免疫法检测细胞中cAMP的量，反映替度格鲁肽对GLP-2R的激活作用。该方法准确度高（相对偏倚：-2.946%~1.426%）、精密度好（GCV：3.228%~4.736%）、操作简便、耗时短，可用于替度格鲁肽产品的质量控制[3]。
图4. HTRF检测cAMP原理
案例3：德谷胰岛素生物学活性检测
中国药科大学利用HTRF技术建立了德谷胰岛素体外生物学活性检测方法，依据2020版《中国药典》四部通则9401、1431进行方法学验证（相对偏倚：−4.1%～−0.9%，GCV均小于11%，线性R²≥0.98），结果均符合方法验证指导原则和生物检定统计法规定。该方法可用于研发、过程控制、终产品放行及生物类似药的研究，具有成为现有药典标准方法替代方法的潜力[4]。
图5. HTRF检测德谷胰岛素原理
HTRF在QC放行中的方法验证
上述案例表明，HTRF方法能够满足ICH Q2 R2等国际质量标准对CQA检测的要求，涵盖效价、纯度及受体结合检测等多个维度。《中国药典》四部通则9401、1431为HTRF方法的验证提供了明确的指导框架，涵盖专属性、相对准确性、精密度、线性和范围等关键指标的评估要求。在实际应用中，HTRF方法验证通常包括以下关键指标：
1. 专属性：仅与目标抗原或抗体发生反应，无交叉反应。
2. 相对准确性：不同效价水平的相对偏倚在±20%范围内。
3. 精密度：不同效价水平的GCV不超过20%。
4. 线性与范围：理论相对活性与实际测得相对活性的相关系数在0.98以上。
5. 稳定性指示能力：可反映破坏性样品的活性变化趋势。
综上，HTRF技术不仅在方法学上优于传统ELISA，更在实际QC放行场景中得到了中检院等权威机构的验证支持。对于生物制药企业QC部门而言，引入HTRF方法可有效缩短检测周期、降低操作变异、提升通量与自动化适配能力，同时满足国内外药典的严格验证标准。随着更多生物制品类型的方法学建立与推广，HTRF有望逐步成为活性检测的主流平台技术，为生物药质量控制提供更高效、更可靠的解决方案。
- 参考文献 -
1. Chin Med Biotechnol,April 2022,Vol. 17,No. 2
2. Chin J Pharm Anal 2019,39(1)
3. Acta Pharmaceutica Sinica 2025, 60(1): 211−217
4. Acta Pharmaceutica Sinica 2024, 59(12): 3347−3353
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