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本文介绍了一套高产能AAV9两步纯化工艺：采用AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和填料进行亲和捕获，搭配AVIPure™ HiPer™ QA阴离子交换填料进行精纯。大孔HiPer™具备大对流孔，可实现快速传质、高结合载量，并支持短保留时间下运行。该工艺可直接上样裂解澄清液，最大程度降低工艺复杂度，维持较高病毒回收率，同时有效富集完整衣壳。整套工作流程通量高、杂质去除效果优异，可高效分离空衣壳与完整衣壳，为提升制备产能、降低下游纯化成本提供可行方案。

二、材料与方法

亲和捕获的初始料液为含有AAV9病毒颗粒的HEK293裂解澄清液。该AAV9载体携带编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的单链DNA基因组。原料体积7.7 L，病毒颗粒滴度1.3×10¹² VP/mL，载体基因组滴度4.0×10¹¹ VG/mL，完整衣壳占比44%。亲和捕获使用10 mL AVIPure™ HiPer™ AAV9层析柱（内径1.6 cm，柱高5 cm），保留时间0.5 min。上样载量为5×10¹⁴ VP/mL填料；7.7 L澄清料液总病毒颗粒约1×10¹⁶ VP，分两个上样循环完成处理，每个循环时长略高于3 h。

表1 AVIPure HiPer AAV9 亲和捕获操作方法

阴离子交换层析（AEX）精纯阶段：亲和步骤收集的产物使用25 mM BTP溶液，pH 9.0稀释，以0.5 min保留时间上样至HiPer QA层析柱。首先采用1 mL层析柱（内径0.5 cm，柱高5 cm）开展线性梯度摸索实验，上样载量5×10¹³ VP/mL填料，标定空衣壳、完整衣壳对应的洗脱电导率。确定空衣壳洗脱电导率为3.7 mS/cm，完整衣壳洗脱电导率为6.3 mS/cm。随后使用10 mL层析柱（内径1.6 cm，柱高5 cm），上样载量5×10¹³ VP/mL填料，对比两种梯度洗脱策略。

第一种策略：上样电导率3.7 mS/cm，空衣壳随流穿除去，随后以6.3 mS/cm单一步骤洗脱完整衣壳。该方案优先保障终产品纯度，但存在完整衣壳回收率偏低的风险。

第二种策略：采用更低的上样电导率2.5 mS/cm，使完整衣壳充分结合；依次以3.7 mS/cm洗脱空衣壳、6.3 mS/cm洗脱完整衣壳。该方案在维持高纯度的前提下，优先保障完整衣壳回收率。

之后开展工艺稳定性验证实验：选用上述优选的两步顺序洗脱策略，在10 mL HiPer QA层析柱上将上样载量提升一倍至1×10¹⁴ VP/mL填料。

分析检测方法：ddPCR定量载体基因组滴度（VG/mL）；ELISA定量病毒颗粒滴度（VP/mL）；SECMALS用于HiPer™ QA洗脱组分分析，可作为ddPCR与ELISA的替代/互补手段，评价空/完整衣壳占比以及各组分回收率。

表2 HiPer QA阴离子交换精纯实验及关键操作条件汇总

四、结果与讨论

亲和捕获：直接上样，实现高产能纯化。

AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和步骤可直接处理7.7 L HEK293细胞病毒裂解澄清液，捕获前无需预浓缩步骤 (图1)。该步骤在仅30 s短保留时间条件下实现84%病毒颗粒回收率，比产能可达1.2×10¹⁴ VP/mL填料/h。除高回收率之外，亲和步骤杂质去除效果优异：宿主细胞蛋白（HCP）对数去除率4.1 LRV，宿主细胞DNA（HCDNA）对数去除率2.7 LRV（表3）。以上结果证明大孔HiPer™树脂结构可以实现高载量、高通量处理，同时简化整体纯化流程。

图1 AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和捕获色谱图，两次处理循环（A：循环1；B：循环2）

表3 AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和捕获步骤性能参数，数值HiPer™ QA梯度摸索：确定空完整衣壳分离操作区间

线性梯度摸索色谱图可观察到空衣壳、完整衣壳分别富集在不同电导率区间，为后续工艺开发确定实际操作条件（图2）。空衣壳约在3.7 mS/cm条件下优先洗脱，完整衣壳洗脱电导率约6.3 mS/cm；以此为基础开发可放大的梯度洗脱方案，平衡产品纯度与回收率。

图2 HiPer™ QA线性梯度摸索色谱图，用于AAV9空衣壳/完整衣壳分离。电导率标定得到空衣壳洗脱条件3.7 mS/cm，完整衣壳洗脱条件6.3 mS/cm。顺序洗脱：保证回收率，同时实现完整衣壳高度富集

两种梯度洗脱方案工艺侧重点不同。单步洗脱方案操作简单、终产品纯度高，但大量载体基因组损失在流穿组分（图3A，表4）。与之相比，顺序洗脱策略可以更好保留并回收完整衣壳，同时仍可有效区分空衣壳和完整衣壳。SECMALS结果显示终产物组分的载体基因组回收率显著提升，因此选择顺序洗脱方案开展后续评价。

图3 HiPer QA单步洗脱(A)与顺序梯度洗脱(B)色谱图

表4 载量5×10¹³ VP/mL，单步洗脱与顺序洗脱的HiPer QA精纯性能（SECMALS检测）高上样载量条件下工艺性能稳定

当填料上样载量提升一倍至1×1014 VP/mL，顺序洗脱工艺仍可维持良好分离效果（图4）。流穿组分未检出载体基因组，证明该上样条件下产物结合充分（表5）。不同分析手段测得的回收率、完整衣壳占比存在一定差异；但SECMALS以及正交检测方法ddPCR+ELISA均证实终产物组分中完整衣壳有效富集，高载量条件下工艺表现稳健。该结果证明HiPer QA精纯流程可放大，同时支持低保留时间运行。

图4 载量1×10¹⁴ VP/mL 条件下HiPer™ QA顺序洗脱色谱图；

工艺条件：2.5 mS/cm上样、3.7 mS/cm洗脱空衣壳、6.3 mS/cm洗脱完整衣壳

表5 载量1×10¹⁴ VP/mL 条件下HiPer™ QA精纯性能，SECMALS、ddPCR+ELISA检测

两步整合工艺

高回收率与优异杂质去除能力将AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和捕获与HiPer™ QA精纯组合，形成精简两步纯化流程：总回收率66%；经ddPCR、ELISA检测完整衣壳实现完全富集；宿主蛋白、宿主DNA的总对数去除率均大于5个数量级（表6）。以上数据证实该两步工艺在简化下游流程的同时，可同时满足产能、产品质量、杂质去除多重要求。

表6 两步整合纯化工艺整体性能

2000 L规模模型分析：凸显产能与成本优势

建立2000 L规模制备模型，对比三套下游纯化流程的工艺产能和耗材成本。在模型设定条件下，HiPer™ 系列填料整套流程在所有对比方案中产能最高、耗材成本最低。性能提升主要来源于：省去TFF超滤浓缩步骤、层析保留时间缩短、通过多循环操作降低填料用量、总处理工时减少。

A：TFF体积浓缩+亲和层析+阴离子交换层析；

B：无TFF浓缩，亲和层析+阴离子交换层析；

C：AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和捕获搭配HiPer QA精纯。

本模型用于对比不同工艺的相对经济性，并非预测特定工厂的实际制备成本。分析结果表明：直接上样亲和捕获搭配高载量精纯，既可以降低下游工艺复杂度，又可以提升制备通量（图5）。

图5 三套2000 L规模AAV纯化流程的模型结果

A：纯化工艺经济产能；B：纯化工艺耗材成本。三套流程分别为：TFF体积浓缩亲和阴离子交换；无TFF浓缩的亲和阴离子交换；AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和+HiPer™ QA精纯。图中分别展示TFF组件、亲和层析介质、阴离子交换层析介质对应的成本。

五、结论

先进大孔HiPer™填料构建了精简的AAV9两步纯化工艺，包含可直接上样的亲和捕获以及选择性分离空衣壳完整衣壳的精纯步骤。AVIPure™ HiPer™ AAV9亲和捕获可高通量处理裂解澄清液，回收率84%，同时高效去除宿主蛋白与宿主DNA。HiPer™ QA精纯可高效分离空衣壳与完整衣壳；填料载量最高可达1×10¹⁴ VP/mL时，仍可得到高度富集完整衣壳的产物。整套整合工艺总回收率66%；ddPCR、ELISA检测完整衣壳达到100%；宿主蛋白、宿主DNA去除均超过5个数量级。在2000 L规模模型中，HiPer工艺相比其他对比方案实现最高产能、最低耗材成本，充分体现直接上样处理、低保留时间、高载量层析对下游制备效率的提升价值。综上，该方案为提升AAV制备产能、降低工艺复杂度和下游成本提供一套可行实践方案。

当AAV纯化迈向更大规模，真正的突破不仅是增加一道工序，而是让每一步都更高效。若您正在探索兼顾回收率、空/满衣壳分离与规模化经济性的下游方案，欢迎联系我们预约技术交流进一步了解AVIPure™ HiPer™ 系列填料如何为您的AAV工艺开发与放大提供支持。

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